Chemische Mutagenese embryonaler Stammzellen der Maus

Abstract

Um die Funktionen der menschlichen Gene aufzuklären, sind Studien an Modellorganismen essentiell. Das wichtigste Modelltier für den Menschen ist die Maus. Mausmutanten sind bei der Aufklärung von Genfunktionen von hoher Bedeutung, doch haben sämtliche etablierte Ansätze zur Gendisruption ihre spezifischen Nachteile. Angesichts der Vielzahl an Genen unbekannter Funktion, die durch großangelegte Sequenzierungsprojekte offenbart wurden, gibt es allgemein einen Bedarf an effizienten und zielgerichteten Ansätzen zur Produktion von Mausmutanten. Die klassische Methode, Gene in Mäusen auszuschalten, verläuft über die Mutagenisierung der Keimbahn mit Hilfe mutationsauslösender Agenzien. Die Generierung von Mausmutanten erfolgt dort nach dem Zufallsprinzip. Demgegenüber bietet die Gendisruption in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) den Vorteil, positive Klone in vitro zu selektieren für die zielgerichtete Produktion von Mutanten. Durch die sequenzunspezifische, chemische Mutagenesierung einer Population embryonaler Stammzellen können statistisch sämliche Gene im Mausgenom getroffen werden. Die in separate Proben zu verteilenden Klone könnten dann nach Mutationen in interessierenden Genen durchmustert werden, um anschließend die selektive Produktion von Mausmutanten zu ermöglichen. Gegenstand dieser Arbeit ist die Etablierung eines solchen Ansatzes. Dazu wurden zwei Agenzien, 4,5',8-Trimethylpsoralen (TMP) und N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU), in ihren Eigenschaften als chemische Mutagene für ES-Zellen charakterisiert. Es stellte sich heraus, dass sich das potenzielle Deletionsmutagen TMP wegen seiner geringen Mutagenität und der Heterogenität induzierter Mutationen nicht als Mutagenisierungsagenz für die Generierung eines ES-Zell-Klonarchivs eignet. Das Punktmutagen ENU hingegen erfüllte die Voraussetzungen hoher Mutagenität und Homogenität des Mutationsspektrums. Es wurden anschließend verschiedene Strategien zur Identifizierung unbekannter Mutationen evaluiert, wobei die Detektion von Exondeletionen auf Transkriptebene die weitaus höchsten Ausdünnungen von Mutationen erlaubte. Da Spleiß-Mutationen einen signifikanten Anteil am ENU-Mutationsspektrum ausmachten, wurde eine rund 40.000 Klone umfassende Bibliothek erstellt mit der Absicht, hochgradig gepoolte cDNA- Proben PCR-basiert nach Spleiß-Mutationen zu durchmustern. Am Beispielgen Kit sollte die Machbarkeit dieses Ansatzes demonstriert werden. Es konnten zwei Klone mit Exondeletion im Kit-Transkript isoliert werden. Mit einem der beiden Klone (Deletion von Exon 18) gelang die Transmission der Mutation durch die Keimbahn. Die heterozygote Mausmutante zeigte einen für Null-Mutationen charakteristischen Phänotyp.

Model organisms play an essential role for studying the functions of human genes. The most important model for the human is the laboratory mouse. Mouse mutants present valuable tools for deciphering mammalian gene functions. The established methods for disrupting gene functions, however, all have their specific shortcomings. Facing large numbers of genes with unknown functions there is a general need for efficient methodology to produce mouse mutants in a directed fashion. Classically, knock-out mice are produced at random using chemical mutagenesis to treat whole animals. In contrast, inactivating genes in embryonic stem (ES) cells bears the advantage to select for positive clones in vitro enabling a gene-driven production of mutants. By chemically mutagenizing a set of ES cells virtually any gene in the mouse genome may be affected. Generating a library of statistically mutated clones would therefore allow to screen for mutations in a particular gene of interest. Mouse mutants could then selectively be generated from clones with mutations identified in that gene. The present work aims at establishing such an approach. To this end, the properties of two mutagens, 4,5',8'-trimethylpsoralen (TMP) and N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), were characterized in ES cells. TMP appeared to be inefficient as a mutagen and showed a heterogeneous spectrum of induced mutations. In contrast, ENU proved to be highly effective. Interestingly, a significant proportion of its mutational spectrum was presented by exon deletions at the mRNA level. Moreover, comparing different PCR-based mutation detection strategies revealed that the detection of deletions was most sensitive. Therefore, a library of approximately 40,000 clones was generated aiming at the identification of splice mutations. As a proof of concept, highly pooled cDNA samples were screened for mutations that lead to exon deletions in the Kit transcript. Two splice mutant clones could be isolated. One of these, lacking exon 18, was successfully employed to transmit its mutation through the mouse germline. The heterozygous mutant displayed a specific phenotype resembling that of a dominant null mutation.