Konstruktion und Expression einer L-Selektin/CD44-Chimäre zur funktionellen Charakterisierung der Transmembrandomäne von L-Selektin

Abstract

Die gezielte Auswanderung der im Gefäßsystem zirkulierenden Leukozyten bei Entzündungsreaktionen sowie die Lymphozytenrezirkulation in lymphatische Gewebe ( Homing ) sind für ein intaktes Immunsystem unerlässlich. Das Auswandern der Leukozyten aus den Gefäßen wird durch ein mehrstufiges, differenziert reguliertes Zusammenspiel verschiedener leukozytärer und endothelialer Adhäsionsmoleküle sowie proinflammatorischer Mediatoren vermittelt bzw. reguliert.

L-Selektin, ein kohlenhydratbindendes Adhäsionsmolekül auf Leukozyten, leitet den ersten Schritt dieser Kaskade ein, indem es den initialen adhäsiven Kontakt mit dem Endothel und das sich anschließende langsame Rollen der Leukozyten auf dem Endothel vermittelt. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass L-Selektin auf der komplex strukturierten leukozytären Zelloberfläche ausschließlich auf den Spitzen der Microvilli, häufig in Clustern formiert, lokalisiert ist. Diese exponierte Lage verbessert unter Strömungsbedingungen in vitro und in vivo die Interaktion mit endothelialen Liganden und erhöht die Anzahl rollender Leukozyten. Welche Regionen des L-Selektinmoleküls bzw. welche Mechanismen an dieser funktionell sinnvollen Positionierung beteiligt sind, ist nur teilweise verstanden. Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen hatten auf eine Rolle des membrannahen zytoplasmatischen Abschnitts von L-Selektin hingewiesen.

Die hochgradige Konservierung des 22 Aminosäuren umfassenden, transmembranären Abschnitts legen darüber hinaus eine Mitwirkung dieser Molekülregion nahe. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch Konstruktion und Expression einer neuartigen L-Selektinmutante (L-Selektin/tmCD44), bei der die Transmembransequenz von L-Selektin durch diejenige von CD44 ersetzt ist, die Grundlage für Untersuchungen dieser Frage zu schaffen.

Hierzu wurde eine cDNA, bestehend aus den Sequenzen der extrazelluären L-Selektindomäne, des transmembranären CD44-Abschnitts und der intrazellulären L-Selektindomäne erzeugt. Während für die Gewinnung der L-Selektinabschnitte durch Vorarbeiten der Arbeitsgruppe die cDNA von L-Selektin zur Verfügung stand, musste die der Transmembrandomäne von CD44 zunächst isoliert werden. Als Grundlage wurde aus humanen Leukozyten mRNA gewonnen und mittels PCR ein cDNA-Fragment generiert, das den entsprechenden CD44-Abschnitt enthielt. Die Verknüpfung der drei cDNA-Abschnitte erfolgte basengenau mit Hilfe der PCR- basierten Methode Splicing by overlap extension ( SOE ); Mutationen der Basenabfolge wurden durch Sequenzierung ausgeschlossen. Nach Klonierung des rekombinanten Gens wurde es in den Zelllinien Nalm6 und K562 zur Expression gebracht. Das Fusionsprotein konnte in beiden Zelllinien mittels Western-Blot nachgewiesen werden, die Expression auf der Zelloberfläche wurde durch FACS- Analyse gezeigt. Durch Nachweis von löslichem L-Selektin (sL-Selektin) im Zellüberstand transfizierter K562-Zellen mittels ELISA konnte gezeigt werden, dass die L-Selektin/tmCD44-Chimäre, ähnlich der Wildtyp-Form, proteolytisch von der Zelloberfläche abgespalten wird. Die Ergebnisse zeigen, dass die L-Selektinchimäre korrekt aus dem endoplasmatischen Retikulum zur Zelloberfläche transportiert und hier in die Plasmamembran insertiert wird.

Damit ist das L-Selektin/tmCD44-Konstrukt hervorragend geeignet, in weiterführenden Untersuchungen den Einfluss der Transmembrandomäne auf die Zelloberflächenlokalisation zu untersuchen.

Darüber hinaus sollte sie bei künftigen Untersuchungen eine Charakterisierung der Rolle der Transmembrandomäne in Hinblick auf weitere funktionelle Merkmale von L-Selektin, wie die Signaltransduktion, die Regulation des Shedding, die effiziente Vermittlung von Zelladhäsion unter Flussbedingungen sowie die räumliche Konfiguration einzelner L-Selektindomänen, ermöglichen.

Somit steht mit der neuartigen L-Selektinmutante ein vielseitiges Instrument zur umfassenden funktionellen Charakterisierung der Transmembrandomäne von L-Selektin zur Verfügung.

For the immune defence, the concerted emigration of circulating leucocytes is crucial in both, inflammatory response as well as lymphocyte recirculation to peripheral lymphatic organs ( homing ). This multistep process is provided by sophisticated interactions between cell adhesion molecules of leukocytes and endothelium as well as proinflammatory mediators.

L-selectin is a carbohydrate-binding cell adhesion molecule on the surface of leucocytes that mediates the initial contact with and the subsequent rolling on the endothelial layer. Electron microscopy of leukocytes reveals a complex surface architecture with numerous prominent protrusions, called microvilli. Interestingly, l-selectin is exclusively localized on the tips of these specialised cell surface domains. This specific exposure of l-selectin improves the interaction with endothelial ligands significantly in vitro and in vivo. It is still poorly defined, which regions of the l-selectin molecule are responsible for this functional reasonable receptor positioning. Previous research focuses on the proximal cytoplasmatic domain. The transmembrane domain of l-selectin consists of 22 amino acids and is highly conserved throughout species, suggesting a specific role concerning the function of l-selectin. To test the hypothesis, that the transmembrane domain of l-selectin is involved in microvillous positioning of l-selectin, a novel l-selectin/CD44-chimera was engineered. In this chimera, the transmembrane domain of l-selectin is replaced by that of CD44.

For chimera construction, a cDNA of the sequences of the extracellular l-selectin domain, the transmembrane domain of CD44 and the intracellular domain of l-selectin was generated. The connection of these parts was performed by the PCR-based method SOE (splicing by overlap extension). Mutations within the sequence were excluded by sequencing. The recombinant gene was expressed in two cell lines (Nalm6, K562). The fusion protein could be detected in both cell lines by Western-blot, the expression on the cell surface was shown by FACS-analysis. Combined, these data show, that the l-selectin/CD44-chimera was transported correctly from the endoplamatic reticulum to the cell surface and was inserted into the membrane.Due to this, the novel l-selectin/CD44-construct is predestined to define the impact of the l-selectin transmembrane domain on l-selectin surface positioning.

Moreover, further research could be show other functional properties of the transmembrane domain affecting signal transduction, regulation of shedding, mediating rolling/tethering or the three-dimensional structure of l-selectin. Thus the novel l-selectin/CD44-chimera provides a versatile tool for defining the functional characteristics of the transmembrane domain of l-selectin.