Induktion und Funktion von Interleukin-10 in CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen

Abstract

CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen (TReg) sind, als zentraler Bestandteil der Immunregulation, an der Suppression inadäquater Immunreaktionen und an der Termination von akuten Entzündungen beteiligt. Ist ihre Anzahl vermindert oder sind sie funktionell defizitär, so ist das immunologische Gleichgewicht gestört und es kommt zum Auftreten von Autoimmunerkrankungen, wie der rheumatoiden Arthritis. In der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, ob ein Transfer von in vitro aktivierten TReg eine Behandlungsoption bei inflammatorischen Erkrankungen darstellen könnte. Hierbei wurde die Induktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10, welches bei einer Vielzahl von Tiermodellen die suppressive Aktivität der TReg vermittelt, als Marker für die Induktion der Effektorfunktion von TReg verwendet. Als optimale Bedingung zur effektiven Induktion von IL-10 erwies sich eine dreitägige Kostimulation über CD28 in Anwesenheit von IL-2 oder einer Kombination aus IL-2 und IL-4. Die suppressive Kapazität der in vitro stimulierten TReg wurde anschließend in einem DTH- und in einem DNA Vakzinierungsmodell in vivo untersucht. Im Gegensatz zu den unbehandelten TReg, vermittelten ausschließlich die in vitro stimulierten TReg eine signifikante suppressive Aktivität. Ferner konnte gezeigt werden, dass das induzierte IL-10 in beiden Tiermodellen maßgeblich zur Suppression beitrug. Bei dem DNA Vakzinierungsmodell konnte zusätzlich ein kooperativer Effekt mit TGF-ß und eine zytokinunabhängige Suppression bei Applikation von antigenspezifischen TReg beobachtet werden. Die funktionelle Analyse der in vivo Suppressionsmodelle lieferte erste Hinweise, dass eine alleinige Optimierung der in vitro Stimulation anhand Induktion des Zytokins IL-10 nicht ausreichend ist, um die suppressive Kapazität der TReg zu beurteilen. So führte u.a. eine eintägige in vitro Stimulation zu einer länger anhaltenden Suppression, obwohl unter diesen Bedingungen geringere Frequenzen an IL-10+ TReg bei Transfer zu verzeichnen war. Da eine langfristige Suppression zur Wiederherstellung des immunologischen Gleichgewichts angestrebt wird, müssten weitere Parameter, wie zum Beispiel die Expression von TGF-ß und Migrationsmarkern, in die Untersuchung mit eingeschlossen werden. Hierbei könnten z.B. die CD103(aE)+ TReg weiter untersucht werden, welche aktiv zu entzündeten Geweben migrieren und für welche in dieser Arbeit eine verstärkt Induktion von IL-10 bei in vitro Stimulation gezeigt werden konnte. In den weiteren Experimenten sollte ferner auch das Überleben und der funktionelle Status der TReg über einen längeren Zeitraum untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation liefern insgesamt erste Hinweise, dass eine Behandlung mit in vitro stimulierten TReg die Effektor T-Zellen und damit auch die Entzündungsreaktion unterdrücken kann. Aussichtsreich erscheinen insbesondere antigenspezifische TReg, da diese eine lang anhaltende Suppression vermitteln und eine generelle Immunsuppression als Nebenwirkung der Therapie vermutlich vermieden werden kann.

Though the incidence of autoimmune diseases is increasing worldwide the treatment options remain limited. Naturally occurring CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T-cells (TReg) play a key role in the maintenance of self tolerance. They can suppress inadequate immune reactions and are essential for the termination of acute inflammatory processes. A reduced number or a functional deficit of the TReg create an imbalance of the immunological equilibrium and autoimmune reactions like rheumatoid arthritis can occur. The aim of this work was to investigate whether a transfer of in vitro activated TReg could present a therapeutic option for the treatment of inflammatory diseases. In many animal models the anti-inflammatory cytokine IL-10 is described to be one of the key components for the immune suppression by TReg. Therefore the induction of IL-10 was used as an indicator for the in vitro activation of the TReg suppressive function. In this work the optimal conditions to induce IL-10 in TReg were a stimulation with anti-CD3 (or antigen-specific) and a co-stimulation with anti-CD28 for 3 days in the present of IL-2 alone or a combination of IL-2 and IL-4. The suppressive capacity of the in vitro stimulated TReg was then analysed in a delayed-type hypersensitivity reaction (DTH) and in a DNA vaccination animal-model. In contrast to untreated TReg only the in vitro stimulated TReg showed a significantly suppressive activity in these experiments. In both animal-models a significantly suppression by the induced cytokine IL-10 could be shown. In the DNA vaccination model furthermore a co-operative suppressive effect by the cytokines IL-10 and TGF-ß could be demonstrated. Using antigen-specific TReg the suppression by was even stronger due to additional suppressive mechanisms. The functional analysis of the in vivo suppression models provided evidence that concentrating on the marker IL-10 alone might not be enough to predict and monitor the suppressive capacity of the in vitro stimulated TReg. If stimulated for 1 day in vitro the TReg showed a stronger suppressive capacity than 3 days in vitro stimulated TReg although the frequency of IL-10+ TReg was lower after 1 day stimulation. In order to achieve and contain a stable immunological equilibrium further analysis of other suppression parameters like TGF-ß and markers for T cell migration should be included into the in vitro protocol. Regarding these migration markers especially the CD103(aE)+ Treg which actively migrate to inflamed tissues are interesting targets. In this work the CD103(aE)+ Treg showed a significantly higher rate of IL-10 induction during the in vitro stimulation experiments. Furthermore the survival and the functional status of the transferred in vitro activated TReg should be followed over a longer period of time in future experiments. The results of this work provide evidence that in vitro activated TReg can suppress effector T cells and inflammatory processes in animal models. Especially the antigen-specific TReg, which showed a strong suppressive potential in this work, are of great interest in this context. These TReg could provide a specific long-time suppression of a self-reactive process without the disadvantage of a general immune suppression.