Funktion und Signaltransduktion neutrophiler Granulozyten bei inflammatorischen Prozessen und ANCA-assoziierten Vaskulitiden

Abstract

Die hier dargestellten Arbeiten beschäftigen sich mit Mechanismen der Aktivierung neutrophiler Granulozyten durch Zytokine und ANCA. Dabei sollten Signalwege identifiziert werden, die als neue anti-inflammatorische Therapieziele dienen können. Im ersten Teil der Habilitationsschrift wurden Untersuchungen zum Einfluss von Statinen auf die ANCA-induzierte Aktivierung humaner neutrophiler Granulozyten dargestellt. Aufgrund der pleiotropen Effekte der Statine untersuchten wir die Hypothese, dass Statine die ANCA- induzierte Sauerstoffradikalenproduktion über die Inhibition intrazellulärer Signalwege vermindern können. Durch Vorbehandlung der PMN mit Statinen wurde eine konzentrationsabhängige Hemmung der durch ERK vermittelten Sauerstoffradikalenproduktion beobachtet. Statine könnten somit zu einer Verminderung inflammatorischer Prozesse bei ANCA-assoziierten Vaskulitiden beitragen. Nachfolgend untersuchten wir die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-B, der die Expression zahlreicher Gene während entzündlicher Vorgänge, bei der Zellproliferation, bei Stressantworten und während der Apoptose kontrolliert. Wir benutzten eine HIV-TAT Sequenz mit einem daran gekoppelten Peptid zur Hemmung des IKK Komplexes, um eine spezifische Hemmung von NF-B zu erzielen. Diese Vorgehensweise stellt eine neue Methode zur effektiven Transduktion in PMN dar. Die Zugabe des Konstrukts während der LPS-verzögerten Apoptose führte zu einer kompletten Hemmung der LPS-induzierten NF-B Aktivierung und des anti-apoptotischen LPS Effektes. TAT Transduktionsdomänen stellen somit ein effizientes Tool dar, um spezifische intrazelluläre Ziele in PMN zu manipulieren. In einem weiteren Teil der Arbeiten beschäftigten wir uns mit der Rolle von Fieber im Rahmen lokaler und systemischer Entzündungsprozesse. Wir testeten die Auswirkung kurzzeitiger Hitzeexposition auf Signaltransduktionswege, die für Sauerstoffradikalenproduktion in Zytokin- getriggerten und ANCA-aktivierten Neutrophilen verantwortlich sind. In geprimten und ANCA-stimulierten PMN konnten wir zeigen, dass kurzzeitige Hitze die Sauerstoffradikalenproduktion durch eine verminderte Phosphorylierung von PI3K/Akt herabsetzen konnte. Wir konnten hier erstmals demonstrieren, dass Hitzeexposition einen inhibitorischen Effekt auf die ANCA-induzierte Neutrophilenaktivierung hat. Dieser Effekt war „dosisabhängig“ in einem pathophysiologisch bedeutsamen Bereich zwischen 37 und 42°C. Um den Einflusses fieberähnlicher Temperaturen in komplexen in vivo Situationen zu prüfen, etablierten wir in einer nachfolgenden Arbeit ein neutrophilenspezifisches entzündliches Hautmodell. Bei normothermen Tieren war nach intradermaler Injektion von GM-CSF und IL-8 eine starke Neutrophileninfiltration sowie eine Aktivierung von NF-B zubeobachten, die in zuvor mit Hyperthermie behandelten Tieren deutlich vermindert war. In vitro beobachteten wir eine signifikante Hemmung der Neutrophilenmigration nach Hitzeexposition durch Inhibierung des PI3K/Akt Pathways. Mit verschiedenen NF-B Assays (Western Blot, EMSA, Taqman) zeigten wir auch ex vivo eine Inhibition von NF-B nach Hitzeexposition. Fieber limitiert inflammatorische Antworten und unsere Ergebnisse stellen den unkritischen Gebrauch fiebersenkender Mittel bei Entzündungen in Frage. Im abschließenden Teil der Schrift ging es uns um die Assoziation von PR3 mit NB1. Diese Interaktion ist für die PR3-ANCA-induzierte Neutrophilenaktivierung von Bedeutung. Eine Hemmung der PR3 NB1 Interaktion wäre demnach als therapeutischer Ansatz sinnvoll. In einem „high-throughput“ Screening mit einer Bibliothek von 20.000 kleinmolekularen Substanzen identifizierten wir Compounds, die zu einer mehr als 70%igen Inhibition der PR3 Bindung an NB1 führten. Die konstitutive PR3 Expression war in Anwesenheit der Compounds nicht zu beeinflussen, während bei der TNF-induzierten Translokation eine signifikante Hemmung auftrat. Eine weitere Modifizierung der Substanzen wäre notwendig, um mit nanomolaren Konzentrationen deren in vivo Nutzen zu etablieren.

The work presented here shows mechanisms of cytokine- and ANCA-activated human neutrophils. We aimed to identify signaling pathways which could be targeted for novel anti-inflammatory therapeutics. In the first part we investigated the impact of statins on ANCA-induced neutrophils. Statins are known to have pleiotropic effects beside lowering cholesterol. We assumed that statins reduce ANCA-induced superoxide production via inhibition of intracellular signaling pathways. Pretreatment of PMN with statins diminished superoxide generation in a concentration dependent manner via ERK-inhibition. Thus, statins might contribute to less inflammation in ANCA-associated vasculitides. Next, we investigated the role of the transcription factor NF-B in PMN. NF-B plays a pivotal role during various inflammatory processes, as during cell proliferation, stress responses and apoptosis. We used a specific NF-B inhibitory peptide coupled to a HIV-TAT protein transduction domain to efficiently transfect human neutrophils. PMN are hard to transfect, the method used was a novel approach, which in our experiments led to an inhibition of LPS-induced delay of apoptosis by inhibition of LPS-induced NF-kB activity. Protein transduction domains are helpful to manipulate intracellular targets in PMN. Furthermore we studied the role of fever in local and systemic inflammation. We tested the effect of short time heat exposure on signaling pathways involved in oxygen generation in cytokine-primed and ANCA-activated neutrophils. Pretreatment of ANCA-activated PMN with fever-like temperatures lead to a diminished superoxide generation via inhibition of Akt phosphorylation. We demonstrated that heat exposure reduced ANCA-induced neutrophil activation “dose-dependently” in a range from 37 to 42 °C. To compare in vitro observed effects of fever-like temperatures with more complex in vivo situations, we established a skin model with neutrophil-specific inflammation. Intradermal injection with GM-CSF or IL-8 showed a gross neutrophil skin infiltration in normothermic mice which was significantly dimished after treatment with hyperthermia. This observation could be explained by additional in vitro experiments were heat reduced neutrophil migration towards GM-CSF and IL-8 via inhibition of PI3K/Akt. We also demonstrated that heat prevented activation of NF-B using different NF-B assays such as western blot analysis, gel shift assay, and RT-PCR experiments. Thus our experiments provide evidence that fever limits inflammatory processes which questions the general use of antipyretic drugs. In the last part we aimed to interrupt the PR3-NB1 interaction which is essential for ANCA-induced neutrophil activation. Inhibition of the PR3-NB1 association would present another therapeutic approach. Using a “high-throughput” screening method with a library of 20,000 small molecule compounds we identified compounds with more than 70% inhibition of PR3 binding to the NB1 receptor. Constitutive PR3 expression on the neutrophil membrane could not be influenced, but we observed a significant inhibition during TNF-induced PR3 translocation. Further compound modification would be needed to investigate its in vivo feasibility in a nanomolar range.