Erythrozyten als Drug Carrier für schwerlösliche Substanzen am Beispiel von Amphotericin B

Abstract

In den letzten Jahrzehnten hat die Häufigkeit invasiver Pilzinfektionen - vor allem verursacht durch C. albicans - dramatisch zugenommen und ist insbesondere bei immungeschwächten Patienten mit einer erheblichen Mortalität verbunden. Dabei spielen die phagozytierenden Zellen des Immunsystems, Mononzyten (MNC) und Neutrophile (PMN), eine entscheidende Rolle in der Infektionsbegrenzung und Dissemination. Das Polyenantibiotikum Amphotericin B (AmB) gehört zum therapeutischen Goldstandard; der klinische Einsatz ist jedoch durch ein fulminantes Nebenwirkungsprofil stark eingeschränkt. Anstrengungen die Toxizität mit der Synthese von AmB Analoga und Lipid- Formulierungen zu mindern, führten nicht zum Erfolg und machen die Entwicklung neuer Strategien dringend erforderlich. Daher hypothesierten wir, dass die Rekruitierung von Leukozyten zum AmB Transport einen idealen Ansatz zur gezielten Verstärkung der Pilzabwehr und Erhöhung der Wirkstoffkonzentration am Infektionsherd bildet. Um das Risiko einer AmB induzierten Zytotoxizität auf die Leukozyten zu reduzieren, wurden Erythrozyten (RBCs) aufgrund ihrer exzellenten Beladungseigenschaften als primäre Medikamententransporter genutzt. Die AmB-Beladung der RBCs erfolgte mit einer AmB Nanosuspension (AmB- NS, Partikelgröße 65 nm) via hypotoner Hämolyse und führte zu Beladungskonzentrationen von 3.81 pg/RBC, entsprechend einer Einschlusseffizienz von 15 – 19% sowie einem prozentualen molekularen AmB Anteil von 41 mol%, der damit deutlich höher lag als bei anderen Lipid- assoziierten Formulierungen. Durch die zusätzliche Inkorporation von Magnetit konnten AmB-NS-RBCs im MRT visualisiert werden und offerieren somit die Möglichkeit des therapeutischen Monitorings. Die leukzytäre Erkennung und Aufnahme der AmB-NS-RBCs war PS vermittelt und sehr effzient. Innerhalb von 4 hr internalisierten > 98% der Leukozyten 4 - 5 AmB-NS-RBCs pro Zelle, das einer AmB-Endkonzentrationen von 14 - 16 pg pro PMN bzw. MNC entsprach. Dies führte bei Inkubation mit C. albicans zu einer sofortigen und dauerhaften Hemmung der intra-und extrazellulären Pilz-Aktivität. Die durch Diffusion freigesetzte AmB-Menge lag dabei über den gesamten Beobachtungszeitraum weit oberhalb der MHK90, jedoch ohne offensichtliche Zytotoxizität für die Immunzellen. Lediglich eine transiente, AmB unabhängige Reduktion der Phagozytosekapazität um ~30% und der ROS Bildung um ~50% konnte identifiziert werden, die sich nach 24 hr wieder normalisierten. Daher muss geschlussfolgert werden, dass das beschriebene DDS eine exzellente Alternative zu den bisher entwickelten AmB-Formulierungen darstellt, angesichts der überragenden intra- und extrazellulären Pilzabtötung unter Erhaltung der leukozytären Funktionalität.

The efficacy of antifungal treatment has been limited by the poor biodistribution of amphotericin B (AmB) due to its pharmacological profile, as well as its severe side effects. Efforts to improve the biodistribution and lower the toxicity with the synthesis of AmB analogues such as AmB esters and lipid-based formulations, have not led to the anticipated success. Therefore, new drug delivery strategies for AmB are urgently needed in order to improve antifungal treatment and enhance host survival. Based on these issues we have developed a cellular drug-delivery system, which incorporates human erythrocytes (RBCs) loaded with an AmB nanosuspension (AmB-NS) thereby allowing subsequent targeting to the leucocytes, the main effector arm of the antifungal immune response. AmB-NS encapsulation in RBCs is achieved by hypotonic hemolysis, leading to intracellular AmB concentrations of 3.8 pg per RBC and an entrapment efficacy of approximately 15%. Furthermore, AmB-NS-RBCs were loaded with magnetite thereby achieving MRI visualization of the drug delivery system and offering additional targeting opportunities. AmB-NS-RBCs were quickly recognized and ingested by the leucocytes. On average more than 98% of the leucocytes ingested 4-5 AmB-NS-RBCs which correlated with an AmB loading capacity of 14-16 pg per leucocyte. Upon phagocytosis, leukocytes showed a slow AmB release over ten days that led to a significant improvement of the intra- and extracellular killing activity while the leucocytes remained functional with no permanent alterations in their cell viability, phagocytic capacity and oxidative burst production. Thus, this drug-delivery method is effective for the transport of water-insoluble substances, such as AmB, and warrants consideration for further testing.