Uptake and intracellular delivery of nanoparticles into mammalian cells

Abstract

In the past two decades nanomaterials have become increasingly important in our daily life. Applications involving nanoparticle technology cover huge areas, such as the textile- and electronic industry, but particularly biomedicine. In fact, a high interest arose for pharmaceutical applications as nanoparticles hold great promise as therapeutic and diagnostic tools to advance detection and treatment of human diseases. For instance, the use of nanoparticle technology enabled remarkable improvements in the treatment of cancer, ranging from increased efficacy of cancer drug delivery to enhanced immunogenicity of cancer vaccines. Hence, it is necessary to fully understand the mechanisms of the interactions of nanoparticles with living cells. This knowledge will help to assess the biological consequences and to eventually design and engineer nanoparticles accordingly for individual pharmacological requirements. In this study, we focused on the effects of the interaction of AHAPS(N-(6-aminohexyl)-aminopropyltrimethoxysilane)-functionalized silica nanoparticles (SiNPs) with human cervix carcinoma (HeLa) cells. We could show that these positively charged amino-functionalized nanoprobes were internalized largely via dynamin 2-dependent caveolar uptake, requiring an intact cytoskeletal network. Following cell entry SiNPs were targeted to late endosomal/ lysosomal compartments, where they accumulated and eventually led to reduced cell viability as demonstrated by MTT assays. The internalization of fluorescently labeled transferrin and epidermal growth factor (EGF) proceeded unaltered in SiNP-filled cells, as did the recycling of fluorescently labeled transferrin. In contrast, we observed that intralysosomal accumulation of SiNPs severly impaired the degradation of EGF. Moreover, levels of the autophagosomal marker LC3 (microtubule-associated protein light chain 3) along with autophagy-specific cargo protein p62 were elevated in SiNP-loaded cells. Given that lysosomes play an essential role in cell physiology crucial for the degradation of internalized cargo (e.g. EGF via degradative sorting) and aggregated proteins (e.g. p62 via autophagy), we examined lysosomal function. However, neither intralysosomal acidification nor intralysosomal hydrolase activity was determined to be responsible for the dysfunction of SiNP-filled lysosomes. We therefore propose that defective lysosomal degradation of autophagic and internalized subtrates results from inhibition of fusion between lysosomes and upstream compartments. In a second project, we used FRET (fluorescence resonance energy transfer) to investigate intracellular drug release from a theranostic macromolecular prodrug (TMP) composed of a dendritic polyglycerol (PG) serving as polymeric nanocarrier, doxorubicin (Dox) and an indodicarbocyanine dye (IDCC). While the PG and IDCC were linked via a tri-functional linker, the chemotherapeutic drug was attached to the delivery system via a pH-sensitive hydrazone bond. Additionally, Dox was located in close proximity to IDCC resulting in the quenching of Dox fluorescence via intramolecular FRET. After initial validation of the cell permeability of the PG-nanoparticles, we measured recovery of Dox fluorescence and evaluated its nuclear accumulation in live cell imaging experiments in HeLa cells. We were able to assure the pH- sensitive intracellular drug cleavage from the TMP by including two additional control conjugates, a non-cleavable, but quenched probe and a cleavable but non-quenching system. In summary, we could demonstrate that this functional probe can act as a reporter and help to understand drug release mechanisms and measure kinetics in real time.

In den vergangenen zwanzig Jahren sind Nanomaterialien ein überaus wichtiger Bestandteil unseres täglichen Lebens geworden. Verfahren basierend auf der Nanopartikeltechnologie finden Anwendungen in verschiedensten Bereichen wie der Textil- und Elektronikindustrie, aber auch in der Biomedizin. In der Tat besteht ein spezielles Interesse an pharmazeutischen Applikationen, da Nanopartikel, eingesetzt als therapeutische und diagnostische Werkzeuge, helfen können die Detektion und vorallem Behandlung von Krankheiten voranzutreiben. Beispielsweise hat der Einsatz der Nanopartikeltechnologie beachtliche Fortschritte in der Behandlung von Krebs ermöglicht, unter anderem eine verbesserte Wirksamkeit im Transport von Krebsmedikamenten und eine erhöhte Immunogenität von Krebsimpfstoffen. Deshalb ist es überaus wichtig die zugrunde liegenden Interaktionsmechanismen zwischen Nanopartikeln und lebenden Zellen zu verstehen. Dieses Wissen wird helfen biologische Konsequenzen beurteilen und anschließend in das Design und die Konstruktion von Nanopartikeln übertragen zu können, die den individuellen pharmakologischen Anforderungen entsprechen. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir uns in erster Linie auf die Interaktion zwischen AHAPS(N-(6-aminohexyl)-aminopropyltrimethoxysilane)-funktionalisierten Siliziumoxidnano-partikeln (SiNP) mit humanen Gebärmutterkarzinomzellen (HeLa) fokussiert. Wir konnten zeigen, dass die positiv geladenen Aminogruppen- funktionalisierten Nanoproben hauptsächlich über die Dynamin 2-abhängige Caveolin-vermittelte Endozytose internalisiert wurden, unterstützt von einem funktionsfähigen Zytoskelettnetzwerk. Nach dem Zelleintritt wurden die SiNP in späte endosomale/ lysosomale Kompartimente transportiert, wo sie sich anreicherten und vermutlich die Zellviabilität beeinträchtigten, wie wir in MTT Tests zeigen konnten. Sowohl die Aufnahme von fluoreszenzmarkiertem Transferrin und epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), als auch das Recycling von fluoreszenzmarkiertem Transferrin in SiNP-beladenen Zellen ging unverändert vonstatten. Demgegenüber haben wir festgestellt, dass die intralysosomale SiNP-Anreicherung den Abbau von EGF stark beeinträchtigt. Zusätzlich wurden in SiNP-akkumulierten Zellen dramatisch erhöhte Werte für den autophagosomalen Marker LC3 (microtubule-associated protein light chain 3), sowie für das autophagiespezifische Frachtprotein p62 gemessen. Da Lysosomen, als essentielle Bausteine für die Zellphysiologie, verantwortlich sind für den Abbau von internalisierten Bestandteilen (z.B. EGF über den degradativen Sortierungsprozess) und aggregierten Proteinen (z.B. p62 über Autophagie), haben wir die lysosomale Funktionalität untersucht. Wir konnten jedoch weder die intralysosomale Ansäuerung, noch die Aktivität von intralysosomalen Hydrolasen als Ursache für die Fehlfunktion von SiNP-beladenen Lysosomen identifizieren. Deshalb vermuten wir, dass der mangelhafte lysosomale Abbau von autophagosomalen und internalisierten Substraten auf die Inhibition der Fusion zwischen Lysosomen und vorgeschalteten Kompartimenten zurückzuführen ist. Parallel dazu haben wir mittels FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) die intrazelluläre Wirkstofffreisetzung eines theranostischen makromolekularen Propharmakons (TMP) untersucht, das aus einem dendritischen Polyglycerol (PG) als polymerem Nanotransporter, Doxorubicin (Dox) und einem Indodicarbocyaninfarbstoff (IDCC) zusammengesetzt war. Alle Komponenten wurden über einen trifunktionalen Linker miteinander vernetzt, wobei wichtig ist, dass der chemotherapeutische Wirkstoff über eine pH-sensitive Hydrazonbindung an das Transportsystem gebunden war. Zusätzlich wurde das Dox in sehr kurzem Abstand zum IDCC positioniert, so dass eine Auslöschung der Doxorubicinfluoreszenz (Quenching) über intramolekularen FRET gewährleistet wurde. Nach einer anfänglichen Validierung der Zellpermeabilität der PG- Nanopartikel haben wir Lebendzellexperimente in HeLa Zellen durchgeführt und dabei die wiederhergestellte Doxorubicinfluoreszenz und seine nukleäre Akkumulierung ermittelt und ausgewertet. Durch den Einsatz von zwei zusätzlichen Kontrollkonjugaten, wovon eines nicht-spaltbar, aber gequencht und das andere spaltbar, jedoch nicht-gequencht wurde, waren wir in der Lage die ermittelten Erkenntnisse über die pH-sensitive intrazelluläre Wirkstofffreisetzung abzusichern. Zusammengefasst konnten wir zeigen, dass diese funktionale Probe als Reporter fungieren und dabei helfen kann Mechanismen zur Wirkstofffreisetzung zu verstehen und ihre Kinetiken in Echtzeit zu erfassen.