Anti-oxidative Stress and Anti-inflammatory Effects of Atorvastatin Improve Endothelial Dysfunction in Experimental Diabetes Mellitus

Abstract

Abstract Background: Increased oxidative stress and low-grade vascular inflammation are hallmarks of endothelial dysfunction in diabetes mellitus. 3 -hydroxy-methyl-3-glutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitors (statins) exert beneficial effects by lipid lowering and pleiotropic effects. In the present study, we evalulated in vivo the influence of a treatment with low- dose atorvastatin on endothelial function, oxidative stress, inflammation and underlying critical molecular pathways in a rat model of diabetes mellitus. Methods: Diabetes mellitus was induced in 8-week-old male Sprague Dawley rats by single administration of streptozotocin (STZ, 70 mg kg-1, i.p.). SD-STZ diabetic rats were treated with atorvastatin (STZ-Ator, 50 mg kg-1, p.o.) or with vehicle for 48 days. Age-matched non-diabetic SD rats were used as controls (SD-Con). At the end of the experimental protocol, serum triglycerides, total cholesterol, LDL- and HDL- cholesterol were determined. Endothelium-dependent vasodilatation was assessed by resistance changes induced by flow-mediated dilatation, after incremental doses of Krebs- Henseleit solution (80, 200 and 600 µl kg-1) in the in vivo autoperfused hindlimb. Sodium nitroprusside (40 µg kg-1, i.a.) was used to estimate endothelium-independent vascular responsiveness to exogenous nitric oxide (NO). Quadriceps muscle NAD(P)H oxidase activity was measured by superoxide dismutase (SOD)-inhibitable cytochrome c reduction using NADH or NADPH as substrate. Gene expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule (VCAM-1), tumor necrosis factor (TNF-a), interleukin (IL)-1b, endothelial NO synthase (eNOS) was assessed by TaqMan quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT- PCR). Western blot was performed to analyze expression of eNOS and underlying signaling transduction pathways: phosphorylated and total extracellular- regulating kinase (ERK) 1/2 and nuclear factor (NF)-kB p65. The expression of VCAM-1 and ICAM-1 in quadriceps was visualized and quantified by immunohistochemistry and image analysis. Results: The SD-STZ diabetic group displayed severe hyperglycemia and hyperlipidemia. Diabetes was associated with severe impairment of endothelium-dependent and -independent vasodilatation. There were significant increases in NAD(P)H oxidase activity and expression of eNOS compared to the SD-Con group, displaying enhanced oxidative stress in diabetic skeletal muscle. These results were paralleled by increased expression of the pro-inflammatory markers of TNF-a, IL-1b, ICAM-1 and VCAM-1, enhanced phosphorylation of ERK 1/2 and upregulated expression of NF-kB p65 in SD-STZ diabetic rats. Low-dose therapy by atorvastatin did not alter the lipid profile but led to a substantial improvement of endothelium- dependent vasodilatation, reduced NAD(P)H oxidase activity and expression of eNOS as well as pro-inflammatory markers (TNF-a, IL-1b, ICAM-1, VCAM-1), suggesting an attenuation of endothelial activation by atorvastatin in SD-STZ diabetic rats, independently of lipid lowering. These effects were associated with inhibtion of phosphorylation of ERK 1/2 and decreased expression of NF-kB p65 pathway. Conclusions: STZ-induced diabetes increased oxidative stress, producing inflammatory responses and endothelial dysfunction in the rat hindlimb. Ator-treatment reduced diabetes-associated oxidative excess and inflammation, which involved the ERK1/2 kinases and NF-kB-pathway, resulting in improved endothelial function, independently of cholesterol-lowering.

Zusammenfassung Ein erhöhter oxidativer Stress und eine niedriggradige vaskuläre Inflammation sind wichtige Induktoren der endothelialen Dysfunktion bei Diabetes Mellitus. 3-hydroxy-methyl-3-glutaryl Koenzym A (HMG-CoA) Reduktase Inhibitoren (Statine) haben durch ihre potente lipidsenkende und pleiotrope Eigenschaft eine protektive Wirkung auf das Gefäßsystem. In der vorliegenden Studie untersuchten wir in einem in vivo diabetischem Rattenmodell den Einfluss einer nierdrigdosierten medikamentösen Behandlung mit dem Statin Atorvastatin (Ator) auf die Progression von oxidativem Stress und Inflammation und der daraus resultierenden endothelialen Dysfunktion. Außerdem wurden potentiell involvierte Signaltransduktionswege auf molekulärer Ebene untersucht. Bei 8 Wochen alten männlichen Sprague Dawley (SD) Ratten wurde durch eine intraperitoneale Einmalinjektion von Streptozotocin (STZ) (70mg/kg) ein Diabetes Mellitus (DM)-Typ-1-ähnlicher Zustand induziert. Die diabetischen Ratten (STZ) wurden über den gesamten Beobachtungszeitraum von 48 Tagen mit Atorvastatin (STZ-Ator) (50 mg/kg, p. o.) oder mit einem Vehikel behandelt. Nicht-diabetische Ratten (SD) dienten als Kontroll-gruppe. Am Ende des Beobachtungszeitraumes wurde die arterielle Gefäßfunktion mit dem in vivo Modell der autoperfundierten Hinterpfote der Ratte gemessen. Eine endothelabhängige Vasodilatation wurde durch Erhöhung des Shear Stress (S) mittels der Applikation verschiedener Volumina Krebs-Henseleit-Puffer (KHS) (80, 200 und 600 µl/kg) induziert. Eine endothelunabhängige Dilatation wurde durch die intraarterielle Gabe des Stickstoffmonoxid (NO)-Donators Nitroprussid Natrium (NN) (40 µg/kg) induziert. Die NAD(P)H Oxidase Aktivität im Muskulus quadriceps wurde mittels der Superoxid Dismutase (SOD)-inhibierbaren Cytochrom C Reduktion gemessen, wobei NADH oder NADPH als Substrat fungierten. Die Genexpression von intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cellular adhesion molecule 1 (VCAM-1), Tumor Nekrosis Factor α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β) und der endothelialen NO-Synthase (eNOS) wurde mittels der TaqMan quantitativen Echtzeit reversen transkriptionalen Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) gemessen. Mittels Western Blot wurden die Expression von eNOS und die folgenden Signaltransduktionsfaktoren analysiert: die phosphorylierte und totale extrazellulär regulierte Kinase (ERK) ½ und der nukleäre Faktor NF-kB p65. Die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 im Muskulus quadriceps wurde immunhistochemisch mit einem digitalen Bildanalyseverfahren analysiert. Die STZ Gruppe wies eine schwere Hyperglykämie (>550 mg/dl) und eine Hyperlipidämie auf. Die diabetischen Bedingungen waren mit einer verschlechterten endothelabhängigen und endothelunabhängigen Vasodilatation im Vergleich zur SD Gruppe assoziiert. Außerdem war die NADPH Oxidase Aktivität, sowie die Expression von eNOS, TNF-α, IL-1β, ICAM-1, VCAM-1, ERK ½ und NF-κB p65 in der diabetischen Gruppe signifikant erhöht im Vergleich zur SD Gruppe. Die niedrigdosierte Atorvastatintherapie in der STZ-Ator Gruppe veränderte das Lipidprofil nicht, führte aber zu einer signifikant ver-besserten endothelabhängigen Vasodilatation im Vergleich zur STZ Gruppe. Die endothel- unabhängige Dilatation unterschied sich jedoch nicht signifikant zwischen STZ und STZ-Ator. Diese Wirkung von Atorvastatin korrelierte mit einer Erniedrigung der NADPH-Oxidase-Aktivität und der eNOS-Expression, sowie mit einer Supprimierung der proinflamma-torischen Marker TNF- α, IL-1β, ICAM-1 und VCAM-1. Außerdem wurde in der STZ-Ator Gruppe die Phosphorylierung von ERK ½ inhibiert und die Expression von NF-kB p65 signifikant reduziert im Vergleich zur STZ Gruppe. In der Hinterpfote der Ratte induzierte der STZ-Diabetes Mellitus Typ 1 eine Erhöhung des oxidativen Stresses und führte zu einer inflammatorischen Antwort des Organismus, die mit der Entwicklung einer endothelialen Dysfunktion einherging. Die Ator-Behandlung von STZ-diabetischen Ratten reduzierte sowohl den oxidativen Stress, als auch die inflammatorische Antwort auf den DM. Diese Wirkung von Ator war mit einer verringerten Progression der endothelialen Dysfunktion assoziiert. Dieser Benefit wurde erreicht, ohne das Lipidprofil signifikant zu verändern.