Untersuchungen zum Einsatz von mittelkettigen Fettsäuren und kurzkettigen organischen Säuren in der Fütterung von Absetzferkeln

Abstract

Mittelkettige Fettsäuren sind in der Ernährung als schnellverfügbare energieliefernde Substrate, aber auch aufgrund ihrer möglichen Wirkungen auf die intestinale Mikrobiota sowie auf die Darmmorphologie bzw. auf das lokale darmassoziierte Immunsystem insbesondere zur Prophylaxe von Durchfallerkrankungen beim Absetzferkel von Bedeutung. Untersuchungen zeigten eine negative Korrelation zwischen steigenden pH-Werten und einer antibakteriellen Wirksamkeit der mittelkettigen Fettsäuren in Abhängigkeit des Dissoziationsgrades. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen sollte überprüft werden, ob die zusätzliche Supplementierung organischer Säuren (Fumar- und Milchsäure) eine pHWert Absenkung im vorderen Verdauungstrakt verursacht und eine verstärkte Wirkung mittelkettiger Fettsäuren auf die Mikrobiota ermöglicht. Durch die Erhebung der Dünndarmzottenlänge und Kryptentiefe bzw. durch die Quantifizierung intraepithelialer Lymphozyten (IEL) sollten außerdem mögliche Effekte der eingesetzten Fütterungsadditiva auf die Dünndarmschleimhaut und auf das lokale darmassoziierte Immunsystem untersucht werden. Zu diesem Zwecke wurden insgesamt 96 abgesetzte männlich kastrierte Ferkel (Alter zu Beginn des Versuchs: 25 ± 1 Tag) in drei folgenden konsekutiven Versuchsreihen auf vier Fütterungsgruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt ein Ferkelaufzuchtfutter nach Empfehlungen der GfE (2006). Der Versuchsfuttermischung der Gruppe KOS wurde 1,05 % eines Produktes bestehend aus Fumar- und Milchsäure zugesetzt. Das Gesamtprodukt enthielt 71 % KOS (56 % Fumarsäure und 44 % Milchsäure) sowie 29 % Siliciumdioxid (SiO2) als Trägerstoff. Dem Futter der Versuchsgruppe KOS und MKFS wurde zusätzlich 0,3 % eines Produkts, welches Caprylsäure (C:8) und Caprinsäure (C:10) enthielt, beigefügt (je 25 % C:8 bzw. C:10 und 50 % SiO2). Die Ferkel der Versuchsgruppe MKFS erhielten ebenfalls 0,3 % eines Produkts über das Futter, welches Capryl- und Caprinsäure (je 25 % C:8 bzw. C:10 und 50 % SiO2). Die Erhebung der zootechnischen Daten erfolgte wöchentlich. Nach einer vierwöchigen Fütterungsphase wurden, verteilt auf drei Sektionstage, je drei Ferkel pro Gruppe (insgesamt neun Ferkel pro Gruppe), euthanasiert. Den Tieren wurde Digesta aus dem Magen, Duodenum, Jejunum, Ileum, Kolon und Rektum entnommen sowie Gewebeproben aus dem mittleren Jejunum. Die Digestaproben dienten zur Bestimmung verdauuungsphysiologischer Parameter (pH-Wert, praecaecale sowie Gesamtverdaulichkeit der Nährstoffe und Trockensubstanz) sowie zur Quantifizierung der Laktobazillen und Enterobakterien mittels qPCR. Die bakteriellen Metaboliten D- und L-Laktat, Ammonium sowie kurzkettige Fettsäuren wurden zur Betrachtung der Fermentationsvorgänge zusätzlich analysiert. Eine Multiplex PCR diente als qualitativer Nachweis vorkommender E. coli- Pathogenitätsfaktoren aus der Digesta des Kolons. Die vier am häufigsten detektierten Pathogenitätsfaktoren (est-II (STb), Stx2e (STx), Fas (987p) und fedA (F18ab)) wurden anschließend via qPCR quantifiziert. Weiterhin erfolgte anhand der entnommenen Gewebeproben aus dem Jejunum, eine Evaluierung möglicher Effekte durch die eingesetzten Futterzusatzstoffe, auf die Länge der Dünndarmzotten und Kryptentiefe bzw. auf die Anzahl IEL. Die Anzahl der IEL wurde mithilfe der Immunhistochemie und Durchflusszytometrie bestimmt, wobei durch erstere Methode lediglich CD3+-IEL erfasst wurden. Durch letztere Methode erfolgte außerdem eine weitere quantitative Erfassung der IEL anhand der exprimierten Oberflächenmoleküle CD2, CD3, CD5, CD8β, CD16 bzw. über den γδ -T-Zellrezeptor. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten lediglich innerhalb der dritten Versuchswoche eine signifikante Beeinflussung der biologischen Leistung der Ferkel durch MKFS in Form einer höheren Lebendmassezunahme. Durch den Zusatz MKFS konnten die pH-Werte im Magen, Jejunum und Ileum signifikant reduziert werden, eine zusätzliche Absenkung der pH-Werte der Digestaproben durch die Fütterung von kurzkettigen organischen Säuren konnte nicht festgestellt werden. Die Fütterung von KOS zeigte einen statistisch abgesicherten hemmenden Einfuss auf die Zellzahl der Enterobakterien im Magen und Kolon. Die Anzahl potenziell pathogener E. coli-Stämme im Kolon konnte des Weiteren tendenziell durch KOS reduziert werden. Der Zusatz MKFS reduzierte, im Vergleich zur Gruppe KOS, signifikant die gemessene Gesamtkonzentration der kurzkettigen Fettsäuren in der Digesta des Jejunums. Im Kolon hingegen bewirke die Fütterung von KOS im Vergleich zur Gruppe MKFS eine abgesicherte Minderung der Gesamtkonzentration der SCFA. Weder die Länge der Dünndarmzotten noch die Kryptentiefe wurden signifikant durch die Zusatzsstoffe beeinflusst. Durch die Etablierung des porzinen monoklonalen Antikörpers PPT3 am Jejunum des Schweines konnte in dieser Arbeit mittels IHC und Durchflusszytometrie (FACS) bestätigt werden, dass der Hauptteil der IEL CD3 exprimiert und den zytotoxischen T-Zellen zugeordnet werden können. Die Ergebnisse der FACS-Daten zeigen außerdem, dass klassische γδ -T-Zellen und Natürliche Killerzellen ebenfalls einen großen Teil der IEL im Epithel des Dünndarms stellen, wobei durch KOS die Anzahl der CD2- / γδ +-IEL (nicht klassische T-Zellen) signifikant erhöht war. Die in dieser Arbeit aufgeführten Auswirkungen MKFS und KOS auf die intestinale Mikrobiota bzw. auf das lokale darmassoziierten Immunsystems bei Absetzferkeln müssen hinsichtlich der Bedeutung für die Tiergesundheit weitergehend geprüft werden.

Medium chain fatty acids (MCFA) constitute a rapidly available energy source for humans and animals, which have been reported to influence the intestinal morphology or local immune system in pigs and to act against potentially pathogenic bacteria. Maintaining the intestinal physiological and microbial balance in weaning piglets is of high importance for the prevention of digestive disorders. It is generally assumed that the antibacterial effects of MCFA depend on the degree of dissociation of the fatty acids. The pH-value of the surrounding environment is therefore of high importance. The aim of this study was to examine the antibacterial effects of MCFA by feeding the MCFA caprylic and capric acid with the short chain organic acids (KOS) fumaric and lactic acid to piglets, which should reduce the pH in the upper digestive tract. By examining the length of the villi and depth of the crypts of the small intestine, and by quantifying the intraepithelial lymphocytes (IEL), the effects of the implemented feed additives on the mucosa of the small intestine and the local immune system could be studied. A total of 96 male castrated piglets (weaned at 25 ± 1 days of age) were randomly assigned into four different dietary groups in three consecutive periods. The control group received a commercial starter diet. The treatment groups received the same diet supplemented with either 1.05% of a product containing 71 % KOS (56 % fumaric acid, 44 % lactic acid and 29 % silicon dioxide (SiO2) as a carrier), or 1.05 % KOS in combination with 0.3 % of an additive with MCFA (KOS+MCFA) containing caprylic acid (C:8) and caproic acid (C:10) (25 % of each acid and 50 % of SiO2). The piglets of the treatment group MCFA received 0.3 % of the same product with C:8 and C:10 (25 % of each acid and 50 % of SiO2). The zootechnical data were recorded on a weekly basis. After a four week feeding period, three piglets per group (nine piglets in total) were euthanized and the contents of the stomach, jejunum, ileum, colon and rectum were collected for further analyses. Digestibility parameters were gathered by determining the pH-values, the apparent ileal and total digestibility of crude nutrients, as well as the dry matter. Lactobacilli and enterobacteria log cell counts were determined in the digesta by quantitative real-time PCR. Intestinal E. coli virulence factors were differentiated via Multiplex-PCR in the colon and subsequently quantified by real-time PCR. Concentrations of bacterial metabolites (lactate, ammonium and SCFA) were determined along the intestinal tract. To investigate the potential impact of the feed additives on the small intestine morphology and local immune system, tissue samples were taken from the middle of the jejunum for villus length and crypt depth measurements, and to quantify IEL. CD3 positive IEL were determined via immunhistochemistry and flow cytometry, whereas CD2, CD5, CD8β. CD16 and γδ -TCR positive IEL were only analysed by flow cytometry. Zootechnical data were affected in week three of the experiment, during which the daily body weigt gain was increased by MCFA. Significantly decreased pH-values were observed in the stomach, the jejunum and the ileum of the piglets fed the diets containing MCFA, whereas the combined feeding with KOS did not enhance the effect. The results of the study indicate a significant reduction of the cell count of enterobacteria in the upper gastrointestinal tract by dietary KOS. In addition, KOS tended to reduce the abundance of E. coli virulence genes in the colon. No influence of treatment was detected for lactobacilli counts along the intestinal tract. The bacterial metabolites D-, L-lactate and ammonium were not influenced by treatment in all intestinal sections. Only the total concentration of SCFA in the jejunum was reduced by dietary MCFA as compared to the KOS group, whereas SCFA in colon were reduced by feeding KOS. Neither the villi lengths nor the crypt depths were influenced by the treatment. The establishment of the antibody PPT3 at the jejunum in pigs confirmed that the majority of IEL expressed the surface marker CD3 and could be classified as cytotoxic T-lymphocytes. However, classic γδ -T-cells and Natural Killer Cells represent a large proportion of IEL. The flow cytometric data indicated that KOS increased the quantity of non-classic γδ -T-cells in the epithelium in the jejunum. In summary, the implementation of feeding MCFA and KOS and the resulting impact on the intestinal microbiota and the local immune system should be further investigated in an infection model trial.