Profibrotische Effekte von Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoragonisten in primären humanen dermalen Fibroblasten

Abstract

In verschiedenen Transplantations- und Autoimmunitätsmodellen erwies sich der neue Immunmodulator FTY720 als wirksam. Zurzeit befindet er sich in der Phase III der Klinischen Prüfung, um seine Wirksamkeit bei der schubförmig verlaufenden Multiplen Sklerose mit Remissionen nachzuweisen. FTY720 wird in vivo und in vitro zum Sphingosin-1-Phosphat (S1P)-analogen FTY720-Phosphat (FTY720-P) aktiviert. Der aktive Metabolit bindet agonistisch an vier der fünf G-Protein gekoppelten S1P-Rezeptorsubtypen. Eine Interaktion zwischen S1P- und Transformierenden Wachstumsfaktor-b (TGF-b) ist inzwischen gut charakterisiert. Da TGF-b ein bekannter Induktor der Myofibroblastendifferenzierung ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob auch FTY720 dazu befähigt ist. FTY720 führte zur Myofibroblastenbildung aus Fibroblasten, wobei das Ausmaß mit einer TGF-b-induzierten Differenzierung vergleichbar war. Um in seine aktive Wirkform überführt zu werden, wird FTY720 von der Sphingosinkinase zum aktivierten Metaboliten phosphoryliert. Eine Inhibierung der Sphingosinkinase verhinderte die Myofibroblastendifferenzierung durch FTY720. Darüber hinaus wurde der S1P3-Rezeptorsubtyp als essentieller Rezeptor in der Signaltransduktion identifiziert, weil FTY720 in murinen S1P3-Knockout-Fibroblasten keine Myofibroblastendifferenzierung mehr herbeiführen konnte. In Experimenten mit Smad3-Knockout-Fibroblasten konnte ein Transduktionsmechanismus über dieses Rezeptor-Smad nachgewiesen werden. Das Lysophospholipid S1P ist ebenfalls in der Lage, die Myofibroblastendifferenzierung in ähnlicher Weise zu induzieren. Zusätzlich führte eine S1P-Applikation in primären humanen Fibroblasten zur Induktion des Bindegewebswachstumsfaktors (CTGF), wobei die Inhibierung von Gai-Protein gekoppelten Rezeptoren diesen S1P-Effekt abschwächte. Da die CTGF- Bildung für die TGF-b-induzierte Myofibroblastendifferenzierung benötigt wird und S1P-Agonisten ebenfalls zur Myofibroblastenbildung führen, wurde getestet, ob der S1P3-Rezeptorsubtyp und auch das Smad3 involviert sind. In S1P3- oder Smad3-Knockout-Fibroblasten zeigte eine S1P-Stimulation nur noch eine deutlich verminderte Wirkung hinsichtlich der CTGF-mRNA-Bildung. Das zeigt, dass S1P die CTGF-Induktion teilweise über den S1P3-Rezeptorsubtyp mit sich anschließender Smad3-Aktivierung transduziert. Bei verschiedenen Fibrosen sind unterschiedliche Wachstumsfaktoren beteiligt, die die fibrotische Pathogenese verstärkend beeinflussen können. Der Epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der Insulin-artigen Wachstumsfaktor 2 (IGF-2) können die TGF-b-vermittelte Myofibroblastendifferenzierung verschiedenartig modulieren. Da S1P-Agonisten die gleiche Signalkaskade bei diesem Prozess aktivieren, wurden verschiedene Co-Stimulationen untersucht. EGF verminderte und IGF-2 verstärkte die TGF-b- und S1P-vermittelte Myofibroblastenbildung. Die CTGF-mRNA-Bildung wurde auch durch EGF und IGF-2 beeinflusst. Interessanterweise verhinderten beide Wachstumsfaktoren die TGF-b- oder S1P-verursachte CTGF-Bildung. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben erstmals die Myofibroblastendifferenzierung durch S1P und FTY720 in primären dermalen Fibroblasten. Darüber hinaus war der natürliche Lipidmediator S1P in der Lage, die CTGF-mRNA-Synthese zu induzieren. Die Transduktionsmechanismen beider Effekte wurden identifiziert und der Einfluss von Co-Stimulationen wurde untersucht.

The novel immunomodulator FTY720 is effective in experimental models of transplantation and autoimmunity, and is currently undergoing Phase III clinical trials for multiple sclerosis. After phosphorylation, FTY720, is a structural analogue of sphingosine-1-phosphate (S1P) and therefore acts as a high-affinity agonist at four of the five G protein-coupled S1P-receptors. It has been well established that their exists a crosstalk between S1P- and transforming growth factor b (TGF-b)-signalling. Furthermore, as TGF-b is the most prominent inductor of fibrosis, we proved the feature of FTY720 to induce differentiation of fibroblasts to myofibroblasts. Indeed, FTY720 provoked myofibroblast differentiation comparable to TGF-b. For biological efficacy, FTY720 required endogenous phosphorylation, since inhibition of sphingosine kinase completely prevented the ability of FTY720 to cause the differentiation process. Moreover, we identified the sphingolysophospholipid receptor S1P3 as the crucial receptor subtype for FTY720-induced myofibroblast differentiation since the effect was abolished in fibroblasts isolated from S1P3-knockout mice. Finally, we discovered that downstream of S1P3-signalling Smad3 activation is essential for myofibroblast differentiation in response to FTY720. The lysophospholipid S1P is able to induce myofibroblast differentiation in a similar manner. Additionally, it was discovered, that the natural mediator leads to Connective Tisssue Growth Factor (CTGF)-mRNA- formation in primary human fibroblasts. Inhibition of Gai-protein coupled receptors diminished this S1P-effect. As CTGF-synthesis is needed in TGF-b-induced myofibroblast formation and S1P-agonists are able to induce myofibroblast formation, it was tested next whether S1P3- and Smad3-signalling is involved in CTGF-mRNA-induction. Indeed, S1P-treatment of S1P3- or Smad3-knockout fibroblasts resulted in an attenuated CTGF-expression. Taken together S1P transduces CTGF-mRNA-formation partly via S1P3-signalling and Smad3-activation. Depending on the type of fibrosis, there are several growth factors which aggravate fibrotic pathogenesis. As there is a known impact of epidermal growth factor (EGF) and insulin-like growth factor 2 (IGF-2) on TGF-b-induced myofibroblast formation and S1P-agonists use the same signalling device, the influence of co-stimulations were of great interest. Clearly EGF extenuated and IGF-2 potentiated differentiation in response to both stimuli TGF-b and S1P. Most interestingly co-stimulation influenced CTGF formation in a different way. Both growth factors abolished CTGF-synthesis completely in response to S1P or TGF-b. The results of this work describe for the first time that S1P and the sphingosine-analogue FTY720 effectuates myofibroblast differentiation in primary dermal fibroblast. Additionally the natural lipid mediator S1P induced CTGF-mRNA-synthesis. Furthermore, signalling pathways of both effects were identified and the influence of co-stimulations was tested.