Charakterisierung der Genexpression von Thrombospondin-1 und des humanen dezidualen Progesteron-induzierten Proteins (DEPP) in humanen Endothelzellen durch Wandschubspannung als Mechanismus der Angioadaptation

Abstract

Der Zusammenhang zwischen der Blutströmung und dem Umbau von Blutgefäßnetzen ist in der Literatur vielfältig beschrieben. Ein möglicher zellulärer Mechanismus zur Regelung dieser Angioadaptation an die Strömung des Blutes ist die strömungsregulierte Genexpression im Endothel. Unter den strömungsregulierten endothelialen Genen ist für die Angioadaptation Thrombospondin-1 (TSP-1) von besonderem Interesse, da es die Angiogenese modulieren kann. In bestimmten Konstellationen hemmt TSP-1 das Gefäßwachstum oder induziert die Apoptose von Endothelzellen. Die bei Strömungsstillstand erhöhte Expression von TSP-1 könnte ein Mechanismus sein, der zur Degradation von Blutgefäßen beiträgt. Der Abbau überzähliger Blutgefäße innerhalb eines Gefäßnetzes ist während der Embryogenese, aber auch im Erwachsenen von zentraler Bedeutung, um funktionell optimierte Gefäßnetze zu erzeugen. Allerdings sind neben antiangiogenen auch proangiogene Wirkungen von TSP-1 bekannt. Diese scheinen allerdings an bestimmte Voraussetzungen, wie seine Konzentration oder seinen proteolytischen Status geknüpft zu sein. In dieser Arbeit sollte die Regulation der Expression von TSP-1 und 9/B (auch als DEPP bezeichnet), einem bisher funktionell nicht charakterisierten, in Endothelzellen exprimierten Gen, durch die von der Strömung auf das Endothel ausgeübte Wandschubspannung genauer untersucht werden.

Dazu wurden primär isolierte und kultivierte humane Endothelzellen (HUVEC, HUAEC, HCMEC, HCEC) sowie zahlreiche etablierte Zell-Linien durch Northern Blot auf die Expression von TSP-1 und 9/B unter statischen Kulturbedingungen untersucht. Lediglich in den primären Endothelzellen wurden beide Gene hoch exprimiert. Um ihre Expressionsregulation durch Wandschubspannung in Endothelzellen zu untersuchen, wurden HUVEC in einem Kegel-Platte-Apparat einer definierten, laminaren Strömung ausgesetzt. Die Expression von TSP-1-mRNA wird ab einer Wandschubspannung von 2 dyn/cm2 nach 24 h und darüber hinaus signifikant supprimiert. Nach erneutem Strömungsstillstand ist die Expression nach 4 h signifikant erhöht und erreicht nach 24 h wieder das Niveau von statisch kultivierten Zellen. Die Stabilität der TSP-1-mRNA ist unter Strömungsbedingungen tendenziell vermindert, so dass ein Teil der beobachteten Regulation posttransskriptional erfolgt. VEGF und Progesteron hatten auf die Konzentration der TSP-1-mRNA keinen Einfluss.

Die Regulation der Expression von 9/B-mRNA durch Wandschubspannung erfolgt genauso wie für TSP-1-mRNA. Die mRNA-Stabilität für 9/B wird dabei wohl nicht verändert, so dass eine transkriptionelle Regulation vorliegen muss. Durch VEGF und Progesteron wird die Expression von 9/B-mRNA nach 2 h nahezu vollständig supprimiert, während sie nach 24 h geringfügig induziert wird.

Die Daten zeigen, dass TSP-1 im Endothel nicht perfundierter Blutgefäße wahrscheinlich höher exprimiert wird und daher zur Degradation dieser "überflüssigen" Blutgefäße beitragen könnte. Falls 9/B ebenfalls antiangiogen wirken sollte, könnte der biphasische Verlauf seiner Expression durch VEGF darüber hinaus ein "Zeitfenster" für proangiogene Effekte darstellen. Die anschließende Limitierung überschießenden Gefäßwachstums könnte eine wichtige physiologische Funktion darstellen, die bei der Tumorvaskularisation im Rahmen des sog. "angiogenetic switches" aufgehoben ist. Weitere Experimente, wie z.B. die Wirkungsbeschreibung des synthetisierten 9/B-Proteins (Southern) auf Endothelzellen und in vivo Studien sind nötig, um genauere Aussagen über die Bedeutung dieses Gens für die Angioadaptation treffen zu können.

The flow-dependent modulation of the endothelial gene expression plays a fundamental role for the regulation of the vascular adaptation to altered flow conditions. Among the shear stress-regulated genes thrombospondin-1 (TSP-1), a modulator of angiogenesis, could play key role for the regulation of the flow dependent angioadaptation. TSP-1 can inhibit vascular growth or induce apoptosis of endothelial cells. Its expression in endothelial cells in absence of blood flow could be a mechanism contributing to vessel degradation (pruning), a process which plays a relevant role during embryogenesis but is present also in the adult organism. However, depending on its concentration or proteolytic state, TSP-1 can also induce angiogenesis. In this study the shear stress dependent expression of TSP-1 and 9/B in endothelial cells was analyzed. 9/B, also known as DEPP: decidual protein induced by progesterone, is a functionally not yet characterized gene.

The expression of TSP-1 and 9/B in primary human endothelial cells (HUVEC, HUAEC, HCMEC, HCEC) as well as several established cell-lines was analysed by Northern Blot under static culture conditions. Only in endothelial cells both genes were strongly expressed. In order to examine in vitro the effect of shear stress exposure on the endothelial expression of TSP-1 and 9/B, endothelial cells were cultured on Petri dishes and exposed to flow using a cone-and-plate-system. The expression of TSP-1 mRNA is significantly suppressed by a shear stress of 2 dyn/cm2 (24 hours) and this effect is slightly increased by 6 dyn/ cm2. With regard to time dependence using 6 dyn/ cm2 suppression of TSP-1 becomes significant after 24 h. By restoration of static conditions (4-24 h) the expression of TSP-1 returns to the value of untreated samples. The reduction of the stability of the TSP-1 mRNA is slightly reduced indicating that at least a part of the reported shear stress dependent inhibition of its expression could be caused by posttranscriptional activity. Vascular endothelial growth factor (VEGF) as well as progesterone had no influence on the expression of TSP-1 mRNA. The regulation of 9/B mRNA-expression by wall shear stress is similar to TSP-1. However 9/B-mRNA seems to be regulated by transcriptional activity because its stability is not influenced by wall shear stress. VEGF and Progesteron transiently inhibit the expression of 9/B-mRNA after 2 hours.

These data show that TSP-1 is probably higher expressed in the endothelium of non-perfused blood vessels and could thus contribute to their degradation. In case 9/B is acting in the same anti-angiogenic way like TSP-1 its transient inhibition by VEGF could hint at a "time-window" for pro-angiogenic effects. The following limitation of excessive vessel growth could play an important physiologic role which is turned off during the "angiogenetic switch" in tumor vascularization. Further experiments are necessary to gain exact information concerning the role of 9/B in the context of angioadaptation.