Charakterisierung fremdstoffmetabolisierender Enzyme in 3D-Vollhautmodellen im Vergleich zu Humanhaut ex vivo

Abstract

Als Alternative zu Tierversuchen gewinnen rekonstruierte humane dreidimensionale Vollhautmodelle (RHS) als Testsysteme in der Entwicklung von Arzneistoffen, Chemikalen und Kosmetika zunehmend an Bedeutung. Dennoch ist das Wissen über deren metabolische Kapazität bisher lückenhaft. Die durch fremdstoffmetabolisierende Enzyme in der Haut katalysierten Reaktionen können jedoch eine entscheidende Rolle bei Prozessen wie Hautsensibilisierung, Genotoxizität oder auch der Wirksamkeit topisch applizierter Pharmaka spielen. In dieser Arbeit wurde die Biotransformationskapazität der kommerziell erhältlichen RHS Phenion®FT und EpiDermTMFT im Vergleich zu normaler Humanhaut ex vivo (NHS) sowie Einzelzellkulturen primärer epidermaler Keratinozyten und dermaler Fibroblasten untersucht. Die Phase-I-Reaktionen katalysierenden Enzyme Monoaminoxidasen (MAO) und Steroid-5α-Reduktasen (5αR) und die Phase- II-Reaktionen katalysierenden Enzyme Sulfotransferasen (SULT) und Glutathion-S-Transferasen (GST) wurden hinsichtlich ihrer basalen Gen- und Proteinexpression bzw. Aktivität analysiert. Die Genexpression der betrachteten Enzyme war in beiden 3D-Vollhautmodellen und Humanhaut vergleichbar. In RHS und undifferenzierten Keratinozyten und Fibroblasten wurden jedoch einige Enzyme unterschiedlich stark exprimiert, was auf Expressionsunterschiede aufgrund verschiedener Differenzierungsstadien des Gewebes hindeutet. Eine Aktivität der MAO konnte nur in NHS detektiert werden. Analysen mittels Western Blot bestätigten eine deutlich geringere Proteinexpression in RHS, Keratinozyten und Fibroblasten. Obwohl die für den Fremdstoffmetabolismus wichtige SULT 1A1 auf mRNA-Ebene detektiert wurde, fehlte in allen untersuchten Geweben SULT 1A1-Protein. Im Gegensatz dazu zeigten beide RHS eine mit NHS und Einzelzellkulturen vergleichbare GST- Aktivität. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Biotransformation des aromatischen Amins 2,4-Diaminotoluol (2,4-DAT) nach topischer Applikation vergleichend in rekonstruierter und exzidierter Humanhaut untersucht. Zusätzlich wurde die Biotransformation von 2,4-DAT in Zellkulturen von Keratinozyten, Fibroblasten und ex vivo Monozyten-abgeleiteten Langerhans- Zellen (MoLC) und Dendritischen Zellen (MoDC) analysiert. In allen untersuchten Geweben wurde in quantifizierbaren Mengen nur das einfach N-acetylierte Derivat N-(3-Amino-4-methylphenyl)acetamid detektiert, was die Dominanz dieser Phase-II-Reaktion andeutet. Dabei zeigten die RHS eine signifikant höhere Enzymaktivität der N-Acetyltransferase (NAT) als NHS, möglicherweise aufgrund einer schnelleren Penetration von 2,4-DAT, die ebenfalls beobachtet wurde. In den Zellkulturexperimenten wurde in Keratinozyten eine deutlich höhere Metabolitmenge detektiert als in Fibroblasten, MoLC und MoDC, die alle ähnliche Metabolitmengen zeigten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die in dieser Arbeit untersuchten rekonstruierten Vollhautmodelle Phenion®FT und EpiDermTMFT adäquate Testsysteme für die Untersuchung von Biotransformationsreaktionen in der Haut darstellen, vor allem hinsichtlich der Phase-II-Reaktionen. Obwohl die RHS eine höhere Biotransformationskapazität für 2,4-DAT aufwiesen, zeigten sie das gleiche Metabolitenmuster wie exzidierte Humanhaut. Sowohl die Ergebnisse zur basalen Enzymexpression als auch die Ergebnisse der Biotransformation von 2,4-DAT nach topischer Applikation deuten eine starke Dominanz von Phase-II-Enzymen (GST, NAT) an, was die These einer vor allem protektiven und entgiftenden Funktion der Haut unterstützt. RHS umgehen speziesabhängige Unterschiede und sind somit geeignete Testobjekte für die Beurteilung dermatotoxikologischer Risiken (Genotoxizität, Sensibilisierung) während der Entwicklung von Arzneistoffen oder Kosmetika.

The use of three-dimensional reconstructed human skin (RHS) as animal-free test systems for risk assessment or the pre-clinical development of drugs and cosmetics gains increasing interest. Still, the knowledge about their biotransformation capacity is limited, although the metabolic activity plays an important role regarding skin sensitization, genotoxicity or the efficacy of topically applied drugs. This study aimed to expand the knowledge of the biotransformation capacity of two RHS Phenion®FT and EpiDermTMFT in comparison with normal human skin ex vivo (NHS) as well as single cell cultures of primary epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Basal enzyme expression and activity were investigated for the phase I catalyzing enzymes monoamine oxidase (MAO) and steroid-5α-reductase (5αR) as well as the phase II enzymes sulfotransferases (SULT) and glutathione-S-transferases (GST). Although differences in the protein expression were observed, gene expression was similar in RHS and NHS but differed between undifferentiated keratinocytes and fibroblasts and RHS for some enzymes indicating altered enzyme expression due to tissue differentiation. MAO activity was detectable only in NHS and Western Blot analysis confirmed a higher MAO protein expression in excised human skin than in RHS or single cells. SULT 1A1 was detected at the mRNA, but not protein level in all tissues. In contrast, both RHS showed a strong GST activity comparable to NHS and single cell cultures. In a second part, the biotransformation of the aromatic amine 2,4-diaminotoluene (2,4-DAT) was examined after topical application and compared in reconstructed as well as excised human skin. In addition to whole skin tissues, biotransformation of 2,4-DAT was investigated in keratinocytes, fibroblasts and ex vivo generated monocyte-derived Langerhans and dendritic cells (MoLC and MoDC) as well. Regarding biotransformation of 2,4-DAT, the mono N-acetylated derivative N-(3-amino-4-methylphenyl)acetamide was the only metabolite detectable in substantial amounts in all test matrices indicating the predominance of this phase II reaction. Here, RHS exceeded N-acetyltransferase activity in NHS significantly, likely due to the faster penetration of 2,4-DAT which was observed as well. In cell cultures, the formation of the metabolite was similar in fibroblasts, MoLC and MoDC, but significantly higher in keratinocytes. In conclusion, the RHS Phenion®FT and EpiDermTMFT are adequate test systems for the evaluation of biotransformation in skin, especially for phase II reactions. Although the RHS showed an enhanced biotransformation capacity of 2,4-DAT, the metabolic pattern was similar to human skin. Both the investigation of basal enzyme expression and the biotransformation of 2,4-DAT after topical application indicate a strong predominance of phase II enzymes (GST, NAT), thus contributing to the protective, detoxifying role of skin. RHS are useful test matrices to study biotransformation-related toxicological endpoints in the development of drugs or cosmetics, thereby overcoming species-related differences.