Immunhistochemische Validierung von Mikroarray-Daten aus dem Vergleich der Genexpressionsprofile des Riesenzelltumors und der rheumatoiden Arthritis

Abstract

Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Systemerkrankung ungeklärter Ätiologie. Morphologische Gemeinsamkeiten des Stromas von high-grade Synovialitiden bei RA und dem semimalignen Riesenzelltumor des Knochens (RZT) wie etwa ein fibroblastenreiches Stroma und das Auftreten multinukleärer Riesenzellen lassen ähnliche Mechanismen des Matrixum-/-abbaus und Invasion beider Entitäten vermuten. Der Vergleich der Genexpressionsprofile beider Gewebe mittels Affymetrix Genchips im Vergleich zu nicht pathologisch verändertem Synovialgewebe (ND) liefert das Ergebnis einer quantitativen Dominanz (ca. 70% Zellanteil) fibroblastenähnlicher Zellen in beiden Entitäten. In diesen Geweben konnte eine zu 70% differentielle Expression von Genen detektiert werden, wobei neun Kandidatengene zur weiteren Untersuchung herausgefiltert wurden. Es handelt sich hierbei um die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR5, den proangiogenetischen Faktor VEGF, die matrixabbauenden Enzyme MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-14 sowie das spezifisch auf aktivierten, tumorähnlichen Fibroblasten exprimierte Fibroblast Activation Protein (FAP). Die vorliegende Arbeit validiert die Ergebnisse der Mikroarray-Analysen mittels semiquantitativer Immunhistochemie und bewertet die Umsetzung des mRNA-Signals in Proteine. Die immunhistochemische Untersuchung der einzelnen Antigene wurde an paraffinfixierten Gewebsschnitten mit jeweils n=10 ND, RA und RZT Gewebsproben ausgeführt. FAP wurde mittels kryokonserviertem Material mit n=10 RA und RZT Proben und n=5 ND Schnitten untersucht. Zur Bewertung der Schnitte wurde der semiquantitative immunreaktive Score (IRS) benutzt. Die untersuchten Antigene weisen in RA Gewebe eine signifikant höhere Expression als in ND-Synovium auf. Alle untersuchen Antigene konnten auf aktivierten Fibroblasten (besonders in der Deckzellschicht von RA-Proben) nachgewiesen werden, was die zentrale Stellung dieser Zellart in der destruktiven Progression beider Erkrankungen unterstreicht. Gene, welche sowohl im Mikroarray und im IRS in RA und RZT gegenüber dem Normalgewebe signifikant erhöhte Expressionswerte aufweisen, können gemeinsame Mechanismen der Gewebsinvasion darstellen. Von den neun untersuchten Genen erfüllen CCR1, CCR5 und FAP diese Kriterien. MMP-9 zeigt Unterschiede zwischen den Array-Daten und der Immunhistochemie. Das Signal im Array kann im Gewebe immunhistochemisch nicht als MMP-9 Protein detektiert werden. Das lässt eine Regulation und damit verbunden eine wichtige Rolle in der frühen Matrixdestruktion vermuten. Ein Korrelationsvergleich zwischen dem IRS der einzelnen Antigene und dem histopathologischen Synovialitis-Score zur Unterscheidung von low- und high-grade Synovialitiden weist für MMP-9 den höchsten Koeffizienten (r=0,847) aus. Erstmals konnte in dieser Arbeit immunhistochemisch MMP-14 auf multinukleären Riesenzellen im RZT nachgewiesen werden. FAP wurde auf synovialen Fibroblasten sowie auf fibroblastoiden Stromazellen des Riesenzelltumors nachgewiesen. Dieser Befund legt möglicherweise nicht nur ausschließlich inflammatorische sondern auch tumorähnliche Mechanismen der Gewebsdestruktion in der Rheumatoiden Arthritis nahe. FAP wurde bereits als therapeutisches Target in der Therapie maligner Erkrankungen diskutiert. Diese Therapie ist gegebenenfalls auf die RA übertragbar. Aktivierte Fibroblasten können über verschiedenste Mechanismen (Matrixdestruktion, Angiogenese) die Progression der lokalen Gewebsdestruktion sowohl in der RA als auch im RZT verursachen und sich an der Knorpel- und Knochendestruktion von Gelenken beteiligen. Hierdurch wird das inflammationsunabhängige Pathogenesekonzept der RA unterstützt.

Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease of unknown etiology. Morphological similarities of high-grade synovitis in RA and the semimalignant giant cell tumor of bone (GCT) regarding stroma and the appearance of multinucleated giant cells lead to speculations of similar mechanisms of matrix-degradation and invasiveness. The comparison of the gene- expresseion-profile of both entities and normal donor synovium (ND) using Affymetrix genechips showed that 70% of the cells are of fibroblastoid origin. Nine candidate genes were chosen from a set of genes showing a 70% differential gene-expression-profile in both RA and GCT compared to ND. The candidate genes are CCR1, CCR5, VEGF, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-14 and FAP (Fibroblast Activation Protein). Immunohistochemical validation of the microarray data for these nine genes war performed in this study. Immunohistochemistry was performed using n=10 paraffin embedded tissue samples of ND, RA and GCT. FAP was validated using cryopreserved frozen sections. Semiquantitave assessment using the immunoreactive score (IRS) was performed. All nine candidate genes showed a higher expression in RA compared to ND tissue. All candiate genes could be located on activated fibroblasts emphasizing the central role in matrix-degradation and invasiveness. Candidate genes showing significant upregulation in RA and GCT in both microarray and IRS testing comapred to normal ND can be links between the pathogenesis of both entities. Of the nine candidate genes only CCR1, CCR5 and FAP fulfill these demands. MMP-9 shows differential expression in microarray and immunohistochemistry. Microarray signals in ND tissue are not translated into protein signals in immunohistochemistry. Correlation comparison between IRS and the semiquantitative synovitis score that differentiates between low- and high-grade synovitis reveals the highest correlation-coefficient (r=0.847) for MMP-9. For the first time MMP-14 could be detected on multinucleated giant cells in GCT in this study. FAP was found on activated fibroblasts in RA and GCT stroma. This implies not only inflammatory but also tumor-like aspects of matrix-degradation in RA. FAP has been tested as a therapeutical target in different tumor diseases. These results may be applicable in RA therapy. Activated fibroblasts play important roles in matrix-degradation and angiogenesis and actively participate in destruction of cartilage and bone in RA and GCT. Therefore the concept of inflammation-independent pathogenesis of RA is supported by this study.