Identification of protein biomarkers for chronic kidney disease progression using state-of-the-art proteomics approaches

Abstract

Proteins are essential for performing the vital functions in the organism and changes in the homeostasis reflect the disease state. Large-scale proteomics studies are commonly performed for the identification of protein biomarkers of complex diseases as chronic kidney disease (CKD), which is the gradual decrease in renal function and is recognized as a major public health burden. Novel biomarkers that allow improved detection at early stages and prognosis of disease development are still needed. Therefore, this thesis is aiming at the identification of proteomics changes related to CKD progression. The first part of the thesis focuses on the identification of proteomics changes of the plasma of patients suffering from CKD. We analysed the plasma proteome of patients with CKD stage 2–4 as well as CKD stage 5 with or without haemodialysis, using liquid chromatography coupled to mass-spectrometry (LC–MS/MS) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pathway analysis confirmed the modification of known processes involved in CKD pathophysiology, including deregulation of fibrin-clot formation and complement activation. Moreover, levels of complement factor D, lysozyme C and leucine-rich alpha-2 glycoprotein were identified to increase with CKD progression. The second part of the thesis focuses on the optimization of the protocol for the identification of CKD progression biomarkers in urine. We compared the reproducibility and efficiency in depleting high-abundance proteins of different methods, using urine samples from CKD patients and controls. Decrease in the amount of albumin and other targets following sample treatment was observed. However, the number of protein identifications did not increase after using these methods. The third part concentrates on the identification of CKD biomarkers in tissue samples using matrix-assisted laser desorption/ionization mass-spectrometry imaging (MALDI-MSI). Fresh frozen renal tissue from patients and controls were analysed to detect molecular signatures of primary glomerulonephritis. MALDI-MSI can generate molecular signatures capable to distinguish between normal kidney and idiopathic glomerulonephritis, with specific signals representing potential indicators of CKD development. A peak with m/z=4048 was identified as an α-1-antitrypsin (A1AT) peptide and the protein was shown to be localized to the podocytes within sclerotic glomeruli by immunohistochemistry. Additionally, correlation of MALDI-MSI findings with urinary proteomics identified identical A1AT peptide as up-regulated in CKD patients prone to fast progression to further stages of the disease. Each of these studies offers novel insights relative to CKD progression. These results will collectively allow for elucidation of the disease progression mechanism, contributing to the discovery of novel therapeutic targets.

Proteine sind verantwortlich für die wichtigsten Funktionen im Organismus, der Homöostase und des Krankheitszustandes. Großangelegte Proteomstudien sind unter anderem mit dem Ziel durchgeführt worden, neue Protein-Biomarkern komplexer Erkrankungen wie beispielsweise der chronischen Nierenerkrankungen (CKD) zu identifizieren. Gegenwärtige werden Biomarker zur Frühdiagnostik und Progression der CKD intensiv gesucht Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es daher einen Beitrag zur Identifizierung von proteomischen Änderungen im Rahmen der CKD zu leisten und dadurch neue Biomarker zu beschreiben zu könen. Der erste Teil der Dissertation konzentriert sich auf die Identifizierung von proteomischen Veränderungen im Plasma von CKD-Patienten. Es wurde das Plasma- Proteom von CKD-Patienten in CKD Stadium 2-4 und 5 mit oder ohne Hämodialyse mittels Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA) untersucht. Pathway-Analysen bestätigten Modifikation der bekannten Stoffwechselprozesse, die in der CKD- Pathophysiologie beteiligt sind. Dazu gehört die Deregulierung der Fibrin- Gerinnselbildung und die Aktivierung des Komplements. Außerdem konnte festgestellt werden, dass das Niveau von Komplementfaktor D, Lysozym C und leucin-reichen alpha-2-Glykoprotein mit der CKD-Progression erhöht wird. Der zweite Teil der Dissertation konzentriert sich auf die Optimierung des Protokolls zur Identifizierung von CKD-Progressionsbiomarkern im Urin. In dieser Studie verglichen wir die Reproduzierbarkeit und Effizienz der Abreicherung von hochkonzentierten Proteine mit verschiedenen Methoden unter Verwendung der Urinproben von CKD-Patienten und Kontrollen. Abnahme der Menge von Albumin und anderen Analyten nachfolgend der Probenbehandlung wurde beobachtet. Allerdings bliebt die Anzahl der Protein-Identifikationen konstant. Der dritte Teil der vorliegenden Arbeit fokussiert sich auf die Identifizierung von CKD-Biomarkern in Gewebeproben unter Verwendung der Technik des „Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation-Bildgebung“ (MALDI-MSI). Frisches gefrorenes Nierengewebe von Patienten und Kontrollen wurden analysiert um molekulare Signaturen von primären Glomerulonephritis zu erkennen. Mittels MALDI-MSI konnten molekulare Signaturen generiert werden, die zwischen der normalen Niere und idiopathische Glomerulonephritis unterschieden, mit Massensignalen, die potenzielle Indikatoren für die CKD- Entwicklung darstellen. Ein Massensignal bei 4048 (m/z) wurde als ein α-1-Antitrypsin (A1AT) Peptid identifiziert und es wurde durch Immunhistochemie gezeigt, dass das Protein in den Podozyten innerhalb sklerotischer Glomerulie lokalisiert ist. Zusätzlich führte die Korrelation von MALDI-MSI Ergebnissen mit Urin- Proteomik zur Identifizierung eines A1AT- Peptids, das bei CKD-Patienten hochreguliert war. Jede dieser Studien bringt neue Erkenntnisse in Bezug auf die CKD-Progression. Diese Ergebnisse werden die Aufklärung der Progressionsmechanismus der Krankheit erlauben und einen Beitrag zur Entdeckung neuer therapeutischer Ziele leisten.