Investigation of the mechanism of action of a synthetic cyclic antimicrobial peptide

Abstract

Antimicrobial peptides represent an ancient class of molecules which is found throughout the animal and plant kingdom. In higher organisms they are part of the innate immune system and serve as first line defence against infectious pathogens. In contrast to conventional antibiotics, resistance development against antimicrobial peptides is rather low which has attracted a great deal of attention in the field of antibiotic research. Precise knowledge of the mechanism of antimicrobial action provides the basis for the development of novel, highly efficient antibiotic agents which selectively kill microbial pathogens. This study is focused on elucidating the antimicrobial mechanism of action of the synthetic cyclic hexapeptide cWFW. Unlike the majority of antimicrobial peptides, this small molecule does not kill bacteria by permeabilisation of the membrane. In order to analyse alternative mechanisms of action, i.e. peptide translocation into the cytoplasm and demixing of membrane lipids, different peptide derivatives were synthesised to fulfil the technical requirements for the spectrum of methods applied. Peptide modification involved labelling with different fluorescent reporter groups as well as amino acid substitution. Minor changes in the primary structure were found not only to reduce the antimicrobial activity but also to change the non-permeabilising mechanism of action of the parent peptide. However, two derivatives could be identified which conserved the properties of cWFW. Using HPLC analysis and fluorescence microscopy, the bacterial cytoplasmic membrane could be confirmed as target structure. Moreover, we observed pronounced accumulation of the antimicrobial peptide at distinct sites of the lipid matrix. Peptide translocation into the cells, however, could not be detected. In order to characterise peptide interactions with different membrane phospholipids, we performed live cell imaging and isothermal titration calorimetry. We found that cWFW preferentially integrates into membrane regions with high curvature strain such as the division septum and the cell poles. In addition, the cyclic hexapeptide strongly reduced the fluidity of the bacterial membrane and induced a demixing of phospholipids into large domains. The immense impact of peptide-induced phase separation was manifested in the delocalisation of membrane-associated proteins which is suggested to influence vital processes such as cell growth and division. The results obtained in the present study point to a novel mechanism of antimicrobial killing for the cyclic hexapeptide cWFW which is considered of low risk to induce the development of bacterial resistance.

Antimikrobielle Peptide gehören evolutionär betrachtet zu einer sehr alten Klasse von Molekülen und kommen in zahlreichen Tier- und Pflanzenarten vor. In höher entwickelten Organismen stellen sie einen Teil des Immunsystems dar und erfüllen eine essentielle Funktion bei der unspezifischen Abwehr von pathogenen Mikroorganismen. Im Gegensatz zu konventionellen Antibiotika ist die Gefahr der Resistenzentwicklung gegen antimikrobielle Peptide relativ gering, was ihnen eine zentrale Bedeutung für die Erforschung neuartiger Substanzklassen verleiht. Die Untersuchung des antimikrobiellen Wirkmechanismus trägt dabei entscheidend zur Entwicklung innovativer, hoch- spezifischer Antibiotika bei. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Aufklärung des antimikrobiellen Wirkmechanismus des synthetischen, zyklischen Hexapeptids cWFW. Es besitzt eine sehr hohe Aktivität gegen Gram positive und Gram negative Bakterienspezies, allerdings beruht die Wirkung des kleinen Moleküls nicht auf Membran-Permeabilisierung, wie es für die meisten anderen antimikrobiellen Peptide gezeigt wurde. Alternative Wirkmechanismen basieren entweder auf der Translokation von Peptiden ins Zytoplasma der Zellen oder auf direkter Interaktion mit bestimmten Membrankomponenten. Für die Untersuchung dieser Prozesse wurden verschiedene Derivate des Zyklopeptids synthetisiert. Wir konnten zeigen, dass minimale strukturelle Veränderungen, wie der Einbau von Fluorophoren oder Aminosäuresubstitution, generell zu einer Verringerung der antimikrobiellen Aktivität führen und zum Teil eine Permeabilisierung der bakteriellen Membran bewirkten. Dennoch konnten zwei Peptid-Derivate identifiziert werden, bei denen die nativen Eigenschaften von cWFW erhalten waren und die für weitergehende Versuche verwendet wurden. Mittels Fluoreszenzmikroskopie und HPLC-Analyse konnten wir starke Wechselwirkungen des Zyklopeptids mit der bakteriellen Membran und Akkumulation in bestimmten Bereichen der Lipid-Matrix beobachten. Eine Translokation ins Zytoplasma hingegen wurde nicht festgestellt. Um die Interaktion mit bestimmten Phospholipiden genauer zu charakterisieren, wurden Bindungsstudien an lebenden Zellen und, unter Anwendung von isothermaler Titrationskalorimetrie, auf Model-Membran-Level durchgeführt. Es konnte gezeigt werde, dass sich das Zyklopeptid bevorzugt in Lipidbereiche einlagert, die eine hohe Krümmungsspannung aufweisen, wie an den Polen und der Zellteilungsebene. Darüber hinaus reduziert cWFW erheblich die Fluidität der Bakterienmembran und bewirkt eine starke Entmischung von Phospholipiden, was durch die Bildung großflächiger Membrandomänen nachgewiesen werden konnte. Diese Phasenseparation hatte große Auswirkungen auf die Lokalisation und Funktionalität membran-ständiger Proteine, die eine wesentliche Rolle während des Zellwachstums und der Teilung spielen. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen deuten darauf hin, dass die hohe bakterizide Aktivität des synthetischen Zyklopeptids cWFW auf einem neuartigen, bisher unbeschriebenen antimikrobiellen Wirkmechanismus beruht, welcher kaum Risiken für eine Resistenzentwicklung birgt.