Initiale Charakterisierung des humanen ATAC Rezeptors, eines neues Sieben- Transmembran-Rezeptors

Abstract

Ziel der Arbeit war die Charakterisierung des humanen ATAC-Rezeptors (hATACR), eines Sieben-Transmembran-Rezeptors. Zur Analyse des Expressionsspektrums des Rezeptors sollte ein monoklonaler Antikörper (mAk) hergestellt werden. Zunächst wurden zum Screening der Hybridomüberstände verschiedene Transfektanten generiert, die den hATACR an ihrer Oberfläche exprimierten. Für die Herstellung der Antikörper wurden mehrere Mäuse mit einem Peptid immunisiert, das die 31 N-terminalen Aminosäuren des hATACR enthielt. Nach erfolgter Fusion der Milzzellen der immunisierten Mäuse mit dem Myelom P3x63Ag8.653 wurden 588 Hybridome etabliert. Diese wurden in einem mehrstufigen Verfahren auf ihre Spezifität durchmustert. Hybridome, deren Überstände sowohl im ELISA als auch in der Durchflusszytometrie positive Ergebnisse ergaben, wurden subkloniert und (mit Ausnahme des Klones 6F8) aufgereinigt. Auf diese Weise konnten vier mAKs (5C5, 1F1, 6D2, 6F8) etabliert werden, die für weitere Tests herangezogen wurden. Es wurden Immunpräzipitationsexperimente mit den hATACR-Transfektanten durchgeführt, diese wurden auch für Western Blots eingesetzt. Darüber hinaus wurden die mAks in der Immunhistologie getestet. Diese Untersuchungen ergaben, dass der mAk 6F8 zuverlässig den hATACR aus allen Transfektanten immunpräzipitieren konnte. Während der spezifische Nachweis des ATACR-Peptids im ELISA durch die mAks reproduzierbar gelang, war die Anfärbung der ATACR Transfektanten in der Durchflusszytometrie inkonsistent. Der Grund hierfür mag in der Unfähigkeit der mAks liegen, den nativen Rezeptor zu erkennen. Andererseits könnte es möglich sein, dass der transfizierte Rezeptor in einzelnen Transfektanten nicht in seiner physiologischen Konformation vorlag, was bereits von anderen Untersuchern beobachtet worden ist. Mit dem mAk 6F8 konnte jedoch ein Reagenz hergestellt werden, das für die weitere biochemische Charakterisierung des hATACR von erheblichem Nutzen sein wird.

The human ATAC receptor (hATACR, XCL1 or Lymphotactin receptor) is a chemokine receptor that belongs to the superfamily of G protein-coupled receptors. The function and the detailled tissue expression of this receptor are still unknown. The objective of the thesis was to generate monoclonal antibodies (mAbs) against the hATACR and to use them for evaluating the tissue expression of this receptor. First, hATAC receptor transfected cells were generated. Second, the hATACR transfectants were used for generating mAbs against the hATACR. The mAbs were characterized by FACS analysis, immunohistology, immunoprecipitation and western blot and then used to characterize the receptor by FACS analysis and immunohistology. As a result, four mAbs could be established, one of them (6F8) was able to immunoprecipate the hATACR. The specifity of the other three mAbs remains unclear and has to be investigated further. The tissue expression of the receptor could not be clarified: The results of the FACS staining with the mAbs were inconsistent and the immunohistological detection of the hATACR in tissue samples and cytospins by the mAbs did not succeed. Possible reasons for the difficulties in creating mAbs against G-protein coupled receptors are discussed.