Therapie des Pankreaskarzinoms durch Inhibition des Sonic Hedgehog- Signaltransduktionsweges

Abstract

Die Aktivierung des Hedgehog-Patched-Signaltransduktionsweges, welcher durch die Bindung von Hegdehog-Proteinen an den Transmembranrezeptor PTCH oder durch Mutationen im PTCH-Gen selbst aktiviert wird, spielt eine wesentliche Rolle in der Entstehung verschiedener Tumore. Aktuelle Daten belegen, dass Tumoren des Gastrointestinaltraktes, unter anderem Pankreaskarzinome ebenfalls eine Überaktivierung dieses Entwicklungskontroll-Signalweges aufweisen. Eine Inhibition des Signalweges stellt einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung solcher Tumore dar, bei denen eine Signalwegaktivierung vorliegt. Um den Einfluss des Hedgehog-Patched-Signalweges in der Pathogenese humaner Pankreastumore zu klären wurde in einem respräsentativen Tumorkollektiv der membranständige Rezeptor PTCH auf Mutationen untersucht. Es konnte mittels kompetitiver mRNA - Analyse die Aktivität des Hedgehog-Patched-Signalweges in Pankreastumoren dieses Kollektives untersucht werden. Zur Inhibition des Signalweges durch die Behandlung mit dem Signalweg-Antagonisten Hh-Antag wurden in vitro Untersuchungen durchgeführt. Für in vivo Versuche wurden in einem heterotopen Tumormodell nu/nu Nacktmäuse mit dem steroidalen Alkaloid Cyclopamin sowie Cyclopamin + Gemzitabine behandelt. Nach Behandlung und Explantation wurden die Tumore hinsichtich der Zielgenexpression sowie des Proliferations- bzw. Apoptoseverhaltens untersucht. Bei einem Großteil der Tumore konnte eine deutliche Überexpression der Zielgene GLI-1 und PTCH im Vergleich zum jeweiligen Pankreas-Normalgewebe nachgewiesen werden. Die Behandlung mit dem Smo-Inhibitor Hh-Antag führte zu einer deutlichen Reduktion der Proliferationsrate in-vitro, die Therapie mit Cyclopamin in Kombination mit Gemzitabine zu einer deutlichen Reduktion des Tumorwachstums in vivo. Untersuchungen hinsichtlich der Zielgen-Expression der behandelten Tiere zeigten eine Reduktion der Expression von PTCH nach Behandlung mit Cyclopamin, was für eine Inaktivierung des Signalweges auch in-vivo spricht. Zusammenfassend konnte in der hier vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass der Sonic-Hedgehog-Signalweg im humanen Pankreaskarzinom aktiviert ist. Eine medikamentöse Inhibition des Signalweges ist in vitro sowie in vivo möglich. Dies zeigt sich nicht nur anhand einer reduzierten Expression von Hedgehog-Zielgenen unter der Therapie, sondern spiegelt sich auch im reduzierten Tumorwachstum wider. Die Inhibition des Sonic-Hedgehog- Entwicklungssignalweges stellt einen neuartigen, interessanten Therapieansatz zur Behandlung des Pankreaskarzinoms dar. In weiteren Studien sollten die Möglichkeiten der Signalwegsinhibition in der Behandlung maligner Tumore weiter verfolgt werden.

Activation of the hedgehog signal transduction pathway, triggered by hedgehog binding to the transmembrane receptor PTCH or by mutations in the PTCH gene, plays an important role in the development of various tumors including cutaneous basal cell carcinomas and cerebellar medulloblastomas. Recent findings indicate that digestive tract tumors including pancreatic adenocarcinomas also display increased hedgehog signaling activity due to an abnormal expression of the secreted hedgehog ligand sonic hedgehog (Shh). To investigate if alterations of PTCH may also be involved in the pathogenesis of pancreatic adenocarcinoma we screened human pancreatic carcinomas and 3 cell lines for mutations using single-strand conformation polymorphism analysis (SSCP) of all coding exons and direct sequencing. Furthermore, the expression levels of known hedgehog target genes were determined using the competitive RT-PCR method. For Inhibition of the pathway in vitro we used the small - molecule inhibitor Hh-Antag. In vivo experiments were performed using a standardized heterotopic tumor model (nu/nu nude mouse) for treatment with the steroidal alkaloid cyclopamine and cyclopamine in combination with gemcitabine. In the majority of pancreatic cancers we found significant overexpression of the target genes GLI-1 and PTCH compared to the corresponding normal pancreatic tissue. Additionally the effects of the small molecule inhibitor of the Hedgehog-Patched pathway Hh-Antag were investigated. Hh-Antag inhibits the function of Smoothened in pancreatic cancer cells; this results in inhibition of cell proliferation. Combination of cyclopamine + gemcitabine showed a significant reduction of tumor growth in vivo. Expresssion of target gens after treatment with cyclopamine showed a reduced expresssion of PTCH indicating an inactivation of the pathway in vivo as well. Overexpression of the taget genes GLI-1 and PTCH indicate an activation of hedgehog signaling in human pancreatic carcinoma. Inhibition of the pathway reduces tumor growth in vitro and in vivo. Therefore, inhibition of hedgehog signaling is a promising approach for treatment of pancreatic carcinoma