dc.contributor.author
Löbker (geb. Klipper), Wiebke Antonia
dc.date.accessioned
2018-06-07T14:34:47Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/101
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-4305
dc.description.abstract
Reconstructed human epidermis and full thickness skin initially created to
substitute seriously wounded skin are of high interest in in vitro tests as
alternative to animal experiments and to compensate the limited availability
of human skin for this purpose. Reconstructed human epidermis is OECD adopted
for testing of e.g. corrosivity and irritancy and appears suitable for the
estimation of percutaneous absorption of compounds, too. However, for
regulatory acceptance and broader use in particular in preclinical drug
development an ideal construct should mimick morphology and present a barrier
but also biotransformation capacity close to human skin. Biotransformation of
substances with dermal absorption can influence penenetration and permeation
and thus the effects of the applied compound. Cutaneous biotransformation may
not only lead to formation of the active form of pro-drugs influencing drug
absorption and efficacy, but also CYP related formation of mutagenic and
sensitising products. Therefore biotransformation in the skin is of relevance
and we need to understand biotransformation activities in human skin as well
as RHE/RHS. For a first approach into biotransformation capacity of RHE/RHS
the current thesis focuses on the prednisolone diester prednicarbate used for
inflammatory skin diseases to unravel the potential of reconstructed tissues
for the investigation of ester-prodrugs. Furthermore, the OECD adopted test
compound testosterone was choosen because of the most complex
biotransformation involving several enzymes. Esteratic cleavage and androgen
(de-)activation in RHS composed of differentiated NHK and NHDF embedded into a
collagen matrix are compared to human skin ex-vivo and RHE formed by
differentiated NHK without dermal equivalent. Well-known differences in the
esteratic, oxidative/reductive and phase II enzyme activity biotransformation
capacity of dermal cells ask for the comparison of the constructs. For
separation and quantification of testosterone and its metabolites an hplc
assay with radiodetection and corticosterone as internal standard was
established and in-house validated. Determination of retention times,
retention factors, separation factors, resolution as well as linearity and
inter-/intraday-variability revealed that the results obtained with this
method were reliable and valid. The lower limit of quantification (LOQ) was
0.0075 MBq/ml (0.7 ng). The quality of the reconstructed tissues in accordance
with OECD TG 431 requirements and resiliency to test compounds and solvents
was determined. No morphological abnormalities and sufficient cell viability
of the RHE EpiDerm and RHS EpiDerm-FT and Phenion FT were detected. In
contrast, the AST2000 failed to meet the requirements and was excluded from
the biotransformation experiments. Because of the still incomplete stratum
corneum formation by RHE/RHS a significant difference in extent of permeation
and biotransformation compared to human skin ex vivo is - at least in part -
due to enhanced uptake seen on a regular base with compounds widely varying in
molecular weight and lipophilicity. However, no qualitative differences in the
metabolic profile of PC were seen in the RHE EpiDerm and both RHS (EpiDerm-FT
and Phenion FT) compared to human skin demonstrating that PC esteratic
cleavage predominantly occurs in the epidermal layers. In fact, experiments
performed within this thesis verified that PC cleavage in NHK exceeded
hydrolysis in NHDF by far. To complete the knowledge on PC biotransformation
by dermal cells, the focus was on HaCaT cell line because of the elimination
of donor-related variability. It could be demonstrated that the proportion of
ester hydrolysis is very similar to NHK, although PD formation in HaCaT was
even faster. Qualitatively, the biotransformation profile of testosterone in
RHE and RHS, especially Phenion FT, was very similar to human skin, too.
Differences in the quantitative formation of testosterone metabolites (HOT,
E2) in human skin and the reconstructed tissues as well as undifferentiated
cell cultures are due to differences in culture conditions and differentiation
status of epidermal cells with well-known influences on enzyme expression and
activity. Considerably lower formation in RHE confirmed the general higher
androgen formation in the dermis. This is confirmed by the more pronounced
expression of relevant enzymes and especially testosterone formation in NHDF
compared to oxidative/reductive biotransformation in NHK. In addition, it
could demonstrated that the experimental setup influences the extent of
biotransformation. It was shown that PC transformation following drug exposure
in membrane inserts was three times higher compared to results obtained using
Franz cell technique. This is explainable by the anticipated higher stress
level in human skin fixed in Franz cell resulting in a lower enzymatic
activity. Thus, all experiments were conducted using the membrane insert
approach. Furthermore, influence of skin cryoconservation on biotransformation
was analysed. Noteworthy, profile and quantity of native PC and its
metabolites were almost identical in freshly excised and cryoconserved human
skin. In contrast, cryoconservation leads to almost complete degradation of
steroidogenic enzymes. Thus, skin viability is relevant for the majority of
dermal enzymes and freezing of skin not an option when biotransformation is
investigated. Interestingly, there is no difference in esteratic cleavage of
PC in female and male skin enhancing esterdrug/prodrug development and
toxicity analysis since activation in human skin is irrelevant of sex. With
targeted enzyme inhibition it was shown that PC is mainly hydrolysed by
carboxylesterases and unspecific serin esterases in human skin. Taken
together, in this thesis it has been demonstrated that reconstructed human
epidermis and especially reconstructed full thickness human skin exerts a
biotransformation capacity and enzyme expression profile close to human skin
although RHE and RHS once more proved overpredictive with respect to skin
penetration. Given this result verified in studies on a large scale of further
subjects of phase I and phase II metabolism, reconstructed human skin may find
its use as validated and accepted standard in in vitro tests for
pharmacological and toxicological testing in particular for preclinical drug
development, thereby reducing animal experiments and eliminating species-
related differences.
de
dc.description.abstract
Ziel dieser Dissertation war es, rekonstruierte humane Epidermis- sowie humane
Vollhautmodelle hinsichtlich ihrer Biotransformationsleistung untereinander
sowie insbesondere gegenüber menschlicher Haut ex vivo vergleichend zu
charakterisieren. Rekonstruierte Hautmodelle - initial zur Versorgung schwerer
Hautwunden entwickelt - haben in den vergangenen Jahren als Ersatzmethoden zum
Tierversuch, bzw. zur Kompensation schwer verfügbarer Humanhaut ex vivo, bei
der pharmakologischen bzw. toxikologischen Prüfung von Substanzen mit dermaler
Absorption (Kosmetika, Pestizide, Arzneimittel zur (trans-)dermalen
Applikation), an Bedeutung gewonnen, insbesondere auch in der präklinischen
Entwicklung. Zur Bestimmung der perkutanen Absorption sowie zur Prüfung der
Hautirritation/-korrosion sind diese Hautmodelle zum Teil bereits validiert
und von der OECD als Testmatrices akzeptiert. Der kutane Metabolismus hat
jedoch einen entscheidenden Einfluss auf das Absorptionsverhalten, auf die
Aktivierung/Deaktivierung in der Haut und somit auf die Wirkung und Toxizität
einer Substanz. Daher ist neben einer vergleichbaren morphologischen Struktur
sowie Barriereeigenschaft rekonstruierter Hautmodelle ebenso eine
vergleichbare Biotransformationsleistung von entscheidender Bedeutung, um ein
in-vitro-Testsystem zu etablieren, dass die menschliche Haut bezüglich
Barriereeigenschaft und metabolischer Fähigkeiten hinreichend widerspiegelt
und somit einen sicheren, reproduzierbaren und wissenschaftlich basierten
Einsatz als Ersatzmethode für Toxizitätsprüfungen ermöglicht. Die
Biotransformation in den rekonstuierten Häuten im Vergleich zu Humanhaut ex
vivo wurde anhand des Glucocorticoids Prednicarbat, ein Doppelester des
antiinflammatorisch wirkenden Prednisolons, sowie des Androgens Testosteron
untersucht, der einem komplexen Metabolisierungsprozess, an dem zahlreiche
Enzyme beteiligt sind, unterliegt. Diese Substanzen werden dermal bzw.
transdermal appliziert. Testosteron findet darüber hinaus als anerkannter
OECD-Standard häufige Anwendung in Penetrationsstudien. Zunächst wurde eine
HPLC-Methode mit Corticosteron als interner Standard zur Trennung sowie zur
quantitativen Bestimmung von Testosteron und der entsprechenden Metabolite
nach Extraktion aus den verschiedenen biologischen Matrices entwickelt und
durch Ermittlung insbesondere der Retentionszeiten, der Auflösung, des
Kapazitätsverhältnisses und des Trennfaktors als Maß für die Trennleistung
sowie der Linearität und Inter-/Intraday-Variabilitäten hausintern validiert.
Der Einsatz eines Radiodetektors ermöglichte eine Nachweisgrenze von 0.0075
MBq/ml (0,7 ng). Für die Testsubstanz Prednicarbat konnte eine bereits
etablierte HPLC-UV/Vis-Methode verwendet werden. Die rekonstruierten Gewebe
wurden histologisch hinsichtlich der Qualität nach Anlieferung sowie der
Einfluss der experimentellen Bedingungen (wie Lösungsmittel, Konzentrationen,
Inkubationsdauer) auf Qualität und Zellintegrität untersucht. Für das
Epidermismodell sowie die rekonstriuerten Vollhautmodelle EpiDerm-FT und
Phenion FT wurden keine Auffälligkeiten, die zu einem Ausschluss aus den
Versuchen geführt hätten, festgestellt. Dagegen erfüllt ein Konstrukt
(AST2000) aufgrund fehlender Barriereeigenschaften die Anforderungen an
rekonstruierte Haut nicht. Es wurde daher von weiteren Versuchen
ausgeschlossen. Ein Vergleich unterschiedlicher Versuchsbedingungen ergab,
dass der Einsatz in der Franz-Diffusions-Zelle, eine etablierte in vitro
Methode zur Bestimmung der kutanen Absorption, einen erhöhten mechanischen
Stress der Haut verursacht und somit aufgrund einer möglichen Enzymschädigung
eine geringere Biotransformation mit sich zieht. Für den weiteren
experimentellen Vergleich der Biotransformation wurde daher ein schonender
Einsatz des humanen und rekonstruierten Hautmaterials im Gewebe-Einsatz
durchgeführt. Hinsichtlich der Esterhydrolyse ergab sich qualitatitv ein sehr
ähnliches Profil der untersuchten rekonstruierten humanen Epidermis- und
Vollhautmodelle gegenüber Humanhaut. Auffällig waren im Vergleich zur
Humanhaut jedoch eine quantitativ erhöhte Esterhydrolyse sowie eine deutlich
erhöhte Permeation beider Testsubstanzen, bzw. insbesondere der entsprechenden
Metabolite, in das Rezeptormedium. Diese ist auf die bekannte geringer
ausgeprägte Barrierefunktion rekonstruierter Haut zurückzuführen. Vergleicht
man die Vollhautmodelle untereinander, sind sowohl das Ausmaß der
hydrolytischen Prednicarbat-Biotransformation als auch der Permeation sehr
ähnlich. Die unwesentlich geringere Biotransformation in der rekonstruierten
Epidermis gegenüber den Vollhautmodellen demonstriert die wesentliche
Beteiligung der Keratinozyten an der Esterhydrolyse. Die rekonstruierten
Hautmodelle weisen auch für Testosteron ein gegenüber Humanhaut sowie
untereinander ein vergleichbares Metabolitenprofil auf, wobei jedoch
quantitative Unterschiede (hauptsächlich in der Bildung der Metabolite
Estradiol und Dihydrotestosteron), die sich im Wesentlichen auf bekannte
Einflussfaktoren wie Kulturbedingungen des biologischen Materials und
Differenzierungsgrade zurückführen lassen, beobachtet wurden. Aufgrund der
bekannten Unterschiede in der Enzymausstattung und -aktivität kutaner Zellen
wurde die Biotransformation der Testsubstanzen zusätzlich in Monolayer-
Kulturen dermaler Zellen (NHK/NHDF) untersucht. Es konnte bestätigt werden,
dass die Esterase-Aktivität epidermaler Keratinozyten wesentlich ausgeprägter
ist als die der humanen dermalen Fibroblasten. Darüber hinaus wurde, um die
Kenntnisse der dermalen Prednicarbatumwandlung abzurunden, erstmals die
Biotransformation in der immortalisierten Keratinozyten-Zelllinie (HaCaT)
untersucht. Es zeigte sich, dass die Esterase-Aktivität dieser Zelllinie mit
der normaler humaner Keratinozyten nahezu vergleichbar ist, jedoch ein
50%-iger Umsatz bereits in kürzerer Zeit erfolgte. Bezüglich der
Biotransformation von Testosteron zeigte sich erwartungsgemäß ein umgekehrtes
Bild; hier konnte eine deutlich erhöhte Biotransformation nach Inkubation der
dermalen Zellen (NHDF) bestätigt werden. Auch für Testosteron konnten durch
die Ergebnisse der Monolayerkulturen und der rekonstruierten Epidermis im
Vergleich zur rekonstruierten Vollhaut die Unterschiede der Biotransformation
von Testosteron in Epidermis und Dermis mit stärkerer Beteiligung des dermalen
Hautkompartiments bestätigt werden. Es konnte ebenfalls bestätigt werden, dass
der Differenzierungsgrad einen erheblichen Einfluss auf die CYP-Aktivität
ausübt, da CYP-abhängige Biotransformationen in der Haut bzw. den Hautmodellen
im Vergleich zur undifferenzierten Zellkultur deutlich erhöht waren. Dies
stimmt mit Genexpressionuntersuchungen in Monolayerkulturen und Haut bzw.
rekonstruierten Hautmodellen mit dem Ergebnis einer zunehmenden Genexpression
bei höherem Differenzierungsgrad überein. Auch der Einfluss der
Kryokonservierung hinsichtlich der Biotransformationseigenschaften des
Hautmaterials (Humanhaut ex vivo) wurde untersucht. Hinsichtlich der Esterase-
Aktivität konnte eine Stabilisierung durch den Einfrierprozess über einen
Zeitraum von bis zu drei Monaten gezeigt werden, wohingegen eine nahezu
vollständige Degradierung der androgen-transformierenden Enzyme festgestellt
wurde. Somit ist die Viabilität der Haut eine wichtige Voraussetzung für die
Mehrheit dermaler Enzyme des Fremdstoffwechsels. Bezüglich der Esterhydrolyse
konnten keine geschlechtsspezifischen Unterschiede hinsichtlich der dermalen
Biotransformationsleistung festgestellt werden. Dies macht die Untersuchung
von (Ester-) Prodrugs einfacher, da ein geschlechtsspezifischer Unterschied
hinsichtlich der Biotransformationsergebnisse ausgeschlossen werden kann. Des
Weiteren konnte mit Hilfe von Enzyminhibitionsversuchen gezeigt werden, dass
an der Esterhydrolyse des Doppelesters neben Carboxylesterasen hauptsächlich
unspezifische Serinesterasen beteilgt sind. Zusammenfassend konnte hiermit
durch den direkten Vergleich der Biotransformationsleistung rekonstruierter
Epidermis- bzw. Vollhautmodelle mit humaner Haut ex vivo gezeigt werden, dass
die untersuchten Hautmodelle für beide Testsubstanzen ein mit der humanen Haut
vergleichbares Biotransformations- und enzymexpressionsprofil aufweisen und
somit - nach hinreichender Validierung - als in vitro-Testmatrix zur
Arzneistoffentwicklung, insbesondere in der präklinischen Phase, und
Toxizitätsprüfung geeignet scheinen. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass
aufgrund der verminderten Barrierefunktion dieser Testmatrices eine erhöhte
und beschleunigte Penetration applizierter Substanzen in die Haut erfolgt und
somit das Ausmaß der Biotransformation im Vergleich zu exzidierter Humanhaut
erhöht ist.
de
dc.format.extent
[12], 143 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Biotransformation human skin
dc.subject
Reconstructed human skin
dc.subject
Reconstructed human epidermis
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::500 Naturwissenschaften
dc.title
Biotransformation Capacity of Reconstructed Human Skin versus Human Skin ex
vivo - analysing Prednicarbate and Testosterone as Example
dc.contributor.firstReferee
Frau Prof. Dr. Monika Schäfer-Korting
dc.contributor.furtherReferee
Frau Prof. Dr. Maria Kristina Parr
dc.date.accepted
2014-04-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000096485-5
dc.title.translated
Biotransformationskapazität rekonstruierter Haut im Vergleich zu Humanhaut ex
vivo am Beispiel von Prednicarbat und Testosteron
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000096485
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