Studies of Protein Structure and Function by X-ray Crystallography and NMR Spectroscopy

Abstract

This research work is a two-part structural biological study, comprising (i) the BRCT region of the human cell-cycle checkpoint protein BRCA1, and (ii) the Bacillus 1,3-1,4-β-glucanase H(A16-M) as scientific subjects. Chapter 1 is a general introduction to molecular cell biology with a focus on cell-cycle regulation, DNA damage signaling and cancer development. Chapter 2 describes the biochemical and structural biological methods with an emphasis on both the rational background and the experimental strategy. Chapter 3 shows the solution NMR structure of the second BRCT domain from BRCA1, whereas Chapter 4 describes the high-resolution crystal structure of H(A16-M) in complex with a natural carbohydrate ligand. Chapter 5 comprises the summary and corresponding publications. The Appendix represents a brief introduction to protein structure and function. It provides additional information with the focus on new developments in structural biology and related fields.

The first part (Chapter 3) relates to molecular cloning and structural characterization of the BRCT region of human BRCA1. BRCT domains are key components of BRCA1 and other DNA-damage responsive cell-cycle checkpoint proteins. Cell biological and biochemical studies have shown that BRCT tandem repeats may activate transcription and bind phosphorylated peptide motifs, thereby mediating the assembly of protein complexes and the activation of cell-cycle checkpoints. In this study, the BRCT domains boundaries were assessed by proteolytic dissection, and the 3D structure of the isolated second BRCT domain (BRCT-c) was determined by solution NMR spectroscopy to elucidate the basis for the observed cellular functions. The results showed for the first time that single BRCT domains may fold properly even in the absence of an intramolecular BRCT tandem partner. Comparison with the crystal structure of the BRCT double repeat revealed that two helices (α1 and α3) slightly reorient in the absence of the first BRCT domain (BRCT-n). This structural deviation suggests, together with previous functional and mutagenesis data, that BRCT-n may possibly modulate the transcriptional activation function of BRCT-c. This raises the intriguing possibility of allosteric cross-talk between the two BRCT domains and, by that, precise fine- tuning of structure and function through direct interactions at the BRCT interface.

In the second part (Chapter 4), the interactions of the Bacillus 1,3-1,4-β-glucanase H(A16-M) with a natural saccharide substrate are analyzed by means of X-ray crystallography. 1,3-1,4-β-glucanases are highly specific enzymes that cleave β-1,4 glycosidic bonds in 3-O-substituted glucopyranosyl units. The crystal structure shows four β-D-glucosyl units (Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc) bound in the substrate binding cleft, corresponding to the non-covalent enzyme-product (E P) complex. The high resolution (1.64 Å) allows unambiguous determination of sugar configuration, conformation and linkage-type. Compared to the Michaelis complex model, the tetrasaccharide ligand is slightly shifted toward that part of the cleft binding the non- reducing end of the substrate, but shows previously unanticipated strong stacking interactions with Phe92 in the catalytic subsite I. Structure analysis of the E P complex provides new insights into the structural basis of carbohydrate binding and processing, and allowed conclusions about the molecular basis for product release.

Diese strukturbiologische Forschungsarbeit beschäftigt sich mit (i) der BRCT- Region des humanen Proteins BRCA1, und (ii) der 1,3-1,4-β-glucanase H(A16-M) aus Bacillus. Kapitel 1 ist eine allgemeine Einführung in die molekulare Zellbiologie, wobei Zellzyklus-Regulation und Krebsentstehung besondere Beachtung finden. Kapitel 2 beschreibt die Methoden und erläutert die experimentelle Strategie. Kapitel 3 zeigt die NMR-spektroskopische Strukturanalyse der zweiten BRCT Domäne von BRCA1. Kapitel 4 beschreibt die Kristallstruktur von H(A16-M) im Komplex mit einem natürlichen Saccharid- Liganden. Kapitel 5 beinhaltet die Zusammenfassung der Arbeit und die dazugehörigen Publikationen. Der Anhang (Appendix) besteht aus einer kurzen Einführung zur Struktur und Funktion von Proteinen. Darin enthalten sind zusätzliche Informationen über neuere Entwicklungen im Bereich der Strukturbiologie und verwandten Forschungsfeldern.

Der erste Teil (Kapitel 3) umfasst die Klonierung und strukturelle Charakterisierung der BRCT-Region von BRCA1, um so die Grundlagen für die zellulären Funktionen besser zu verstehen. BRCT-Domänen sind Schlüsselkomponenten von BRCA1 und anderen Proteinen, die in Reaktion auf DNA- Schädigung den Zellzyklus regulieren. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die beiden BRCT-Domänen von BRCA1 transkriptionsaktivierend wirken und mit hoher Affinität an phosphorylierte Peptidmotive binden. Dies ermöglicht die Assemblierung von Proteinkomplexen und die Aktivierung von Zellzyklus- Kontrollmechanismen. In dieser Arbeit wurden die BRCT-Domänengrenzen durch limitierte Proteolyse ermittelt und die 3D-Struktur der isolierten zweiten BRCT-Domäne (BRCT-c) in Lösung mit NMR-spektroskopischen Methoden bestimmt. Dadurch konnte zum ersten mal gezeigt werden, dass sich einzelne BRCT-Domänen auch ohne weitere intramolekulare BRCT-Interaktionspartner richtig falten können. Ein Vergleich mit der Kristallstruktur der BRCT-Doppeldomäne zeigte, dass sich zwei Helices (α1 and α3) leicht gegeneinander verschieben, wenn die erste der beiden BRCT-Domänen (BRCT-n) fehlt. Diese strukturellen Differenzen lassen vermuten, dass BRCT-n die transkriptionsaktivierende Funktion von BRCT-c beeinflusst, und dass es eine durch direkte Interaktion an der Kontaktstelle vermittelte allosterische Wechselwirkung zwischen den beiden BRCT-Domänen gibt. Durch dieses "Finetuning" könnten schließlich Struktur und Funktion präzise moduliert werden.

Im zweiten Teil (Kapitel 4) werden die Wechselwirkungen der 1,3-1,4-β-Glucanase H(A16-M) mit einem natürlichen Saccharid-Liganden kristallographisch analysiert. 1,3-1,4-β-Glucanasen sind hochspezifische Enzyme, die β-1,4 glycosidische Bindungen in 3-O-substituierten Glucopyranosyl-Einheiten spalten. Die Kristallstruktur zeigt vier β-D -Glucosyl-Einheiten (Glcβ4Glcβ4Glcβ3Glc) in der Substrat-Bindungsstelle und entspricht dem nicht-kovalenten Enzym-Produkt-Komplex (E P-Komplex). Die hohe Auflösung (1.64 Å) erlaubt die eindeutige Bestimmung von Konfiguration, Konformation und Art der glycosidischen Bindung innerhalb der Zuckerkette. Ein Vergleich mit dem Modell des Enzym-Substrat-Komplexes zeigt, dass der Tetrasaccharid-Ligand eine starke, bislang nicht beschriebene hydrophobe Interaktion mit Phe92 in der Bindungsstelle I eingeht. Die Strukturanalyse des E P-Komplexes ermöglicht neue Einblicke in die strukturellen Voraussetzungen für die spezifische Bindung und katalytische Spaltung von natürlichen Saccharid-Substraten.