Testung neuer molekularer Sonden für die Bildgebung von Enzymaktivitäten und der Apoptose

Abstract

Die molekulare Bildgebung nutzt das Prinzip des aktiven Targeting, um zelluläre und biochemische Vorgänge zu visualisieren [199]. Dabei können nicht nur morphologische Veränderungen erkannt werden, sondern auch Kenntnisse zu spezifischen molekularen Gewebeveränderungen gewonnen werden. Für diesen Vorgang werden Substanzen verwendet, die eine spezifische Bindung oder Aktivierung im Zielgewebe aufweisen und somit spezifisch Veränderungen aufdecken können. Ziel dieser Arbeit war die Analyse und Testung neuer molekularer Bildgebungssonden. Im Mittelpunkt standen die spezifische Detektion der Enzymaktivitäten von aktiven Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und von apoptotischen Zellen. Im ersten Teil der Arbeit bildeten die VSOP (very small iron oxide nanoparticles) die Basis für die molekularen Bildgebungssonden. Die VSOP besitzen einen superparamagnetischen Kern, der sie als starkes Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) auszeichnet. Die auf VSOP basierenden Protease-spezifische Eisenoxidnano- partikel (PSOP) werden proteolytisch aktiviert und die mit dem Protein Annexin beschichteten VSOP (AnxA5-VSOP) binden spezifisch an apoptotische Zellen. Für die Herstellung der PSOP wurde die Oberfläche der elektrostatisch stabilisierten VSOP mit Peptid-PEG-Konjugaten beschichtet (PEG, Polyethylenglycol). Das Peptid enthielt eine spezifische Schnittstelle für die MMP-2/9. Bei enzymatischer Spaltung verloren die Nanopartikel ihre sterische Stabilisierung, welche durch die PEG-Hülle hervorgerufen wurde. Die aus der enzymatischen Aktivierung resultierende Aggregation der Partikel konnte in vitro in MRT-Messungen dargestellt werden. Eine Signalveränderung in vivo in stark MMP-exprimierenden Tumoren konnte hingegen nicht gezeigt werden. Die Apoptose-Detektion mit AnxA5-VSOP wurde an chemotherapeutisch behandelten, tumortragenden Mäusen durchgeführt. Die immunhistologischen Untersuchungen zeigten eine Steigerung der Apoptose nach der Behandlung. In den MRT-Messungen konnten allerdings keine signifikanten Signalveränderungen beobachtet werden. Die histologischen Auswertungen zeigten eine Anreicherung von AnxA5-VSOP im Tumorgewebe, jedoch konnte dieser begrenzte Bereich im MRT nicht dargestellt werden. Die optimierten Anx-VSOP konnten hingegen erfolgreich in vivo an einem Myokardinfarktmodell angewendet werden [30]. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Fusionsprotein XTEN-AnxA5 mit dem Ziel einer verlängerten Bluthalbwertszeit für die Apoptose-Bildgebung entwickelt. Als erstes wurde das Protein erfolgreich in E. coli exprimiert und chromatographisch aufgereinigt. Anschließend wurde das Bindungsvermögen von XTEN-AnxA5 an apoptotische Zellen untersucht. Im Vergleich mit dem Wildtyp-AnxA5 wurde, wie erwünscht, kein Unterschied der Bindungsfähigkeit des XTEN-AnxA5 festgestellt. Außerdem wurde die Organkinetik von radioaktiv markiertem XTEN-AnxA5 in vivo untersucht und eine Verlängerung der Blutzirkulationshalbwertszeit um das Neunfache auf ca. 1 h ermittelt. Die NIRF-Bildgebung von chemotherapierten Tumoren zeigte eine deutliche Signalsteigerung, d. h. eine erhöhte Anreicherung von XTEN-AnxA5, im Vergleich zum Wildtyp AnxA5. Für die molekulare Bildgebung der Apoptose erscheint XTEN-AnxA5 daher vielversprechend.

Molecular imaging uses the principle of active targeting to visualize cellular and biochemical processes [199]. In this way, molecular changes not only recognizes morphological changes but also provides information on specific molecular tissue changes. Specific changes are identified by using molecules with specific binding or activation in target tissue. The goal of this project was to analyze and test new molecular imaging probes, focussing on the specific detection of enzymatic activity of active matrix metalloproteinases (MMPs) and apoptotic cells. In the first part of this work, molecular imaging probes on the basis of very small iron oxide nanoparticles (VSOP) were used. VSOP have a superparamagnetic core, making them a strong contrast agent for magnetic resonance imaging (MRI). Protease-specific iron oxide nanoparticles (PSOP) based on VSOP are activated in target tissue, and VSOP coated with the protein annexin (AnxA5-VSOP) bind specifically to apoptotic cells. PSOP were produced by coating electrostatically stabilized VSOP with peptide-PEG- conjugates (PEG, polyethylene glycol). This peptide contained a specific cleavage side for MMP-2/9. The steric stability provided by the PEG was lost upon enzymatic cleavage. This enzymatic activation resulted in aggregated particles, which in turn were detected by in vitro MRI. However, in vivo imaging revealed no change in signal intensity in tumors with high MMP-9 expression. Detection of apoptosis using AnxA5-VSOP was investigated in tumor- bearing mice treated with chemotherapy. While immunhistochemical studies showed increased apoptosis after treatment, no significant changes in signal intensity were observed in MRI. The histological examination showed some accumulation of AnxA5-VSOP in tumor tissue. In contrast, an optimized version of Anx-VSOP was successfully applied and visualized by MRI in a myocardial infarction mouse model [30]. In the second part of this work, a fusion protein called XTEN-AnxA5 was developed with the aim of a prolonged blood half-life for apoptosis imaging. As a first step, the protein was successfully expressed in E. coli and purified chromatographically. Subsequently, the binding capability of XTEN-AnxA5 was investigated. As desired, the binding capability of XTEN-AnxA5 was not found to differ from that of wild-type AnxA5. Furthermore, organ distribution of radioactively labeled XTEN-AnxA5 was investigated in vivo, revealing a longer blood circulation time of approximately 1 h, which is nine times that of wild-type annexin. Nearinfrared fluorescence (NIRF) imaging of chemotherapeutically treated tumors using XTEN- AnxA5 showed an increase in signal intensity compared to wild-type AnxA5. These results suggest that XTEN-AnxA5 is a promising candidate for molecular imaging of apoptosis.