Untersuchungen zur mRNA-Expression des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) der Ratte während

Abstract

Ziel der Untersuchungen war es zum einen, mittels kompetitiver RT-PCR die mRNA-Expression von rCAR1 und rCAR2 in verschiedenen Organen während der peripartalen Phase sowie bei juvenilen und adulten Ratten zu untersuchen. Um weitere Informationen über die Regulation von CAR im kardialen System zu erhalten, sollte die rCAR1ý und rCAR2-mRNA-Expression in neonatalen Rattenkardiomyozytenkulturen in Abhängigkeit von der Zelldichte und der Kulturdauer untersucht werden. Weiterhin erfolgten mit Hilfe eines hCAR- exprimierenden adenoviralen Vektors Untersuchungen zur Bedeutung der CAR- Expression für den adenoviralen Gentransfer in Rattenkardiomyozytenkulturen. Es zeigte sich, dass die mRNA beider rCAR-Isoformen (rCAR1 und rCAR2) in allen untersuchten Organen exprimiert wird, die rCAR2-mRNA-Expression jedoch nur etwa ein Zehntel der rCAR1-mRNA-Expression betrug. Unabhängig von der Expressionshöhe zeigten beide Isoformen in allen untersuchten Organen, mit Ausnahme des Gehirns, einen tendenziell vergleichbaren Expressionsverlauf während der Entwicklung. Die für das Gehirn ermittelten unterschiedlichen Expressionsverläufe zwischen rCAR1- und rCAR2-mRNA deuten darauf hin, dass rCAR2 während der frühembryonalen Gehirnentwicklung von Bedeutung sein könnte. Weiterführende Untersuchungen in dieser Entwicklungsphase könnten dies konkretisieren. Der mittels kompetitiver RT-PCR ermittelte Verlauf der mRNA-Expression von rCAR1 und rCAR2 während der Organentwicklung zeigte vor allem im Gehirn und in der Skelettmuskulatur, aber auch im Herzen und in der Niere während der Embryonalentwicklung eine höhere CAR-mRNA-Expression, die mit zunehmendem Alter im Zuge der Organreifung abnahm. Dieser Rückgang war im Gehirn und in der Skelettmuskulatur besonders drastisch. Dagegen konnte in der Lunge und der Leber keine derartige Beziehung gefunden werden. Untersuchungen an neonatalen Rattenkardiomyozyten demonstrierten, dass die rCAR-mRNA-Expression in Kulturen mit einer geringen Zelldichte 24 h nach der Isolierung deutlich höher war als in Kulturen mit einer höheren Zelldichte (rCAR1 bis 9,1 mal höher; rCAR2 bis 2,1 mal höher) und die Expression mit zunehmender Zelldichte annähernd linear abnahm. Eine Verlängerung der Kulturdauer über 48 und 72 Stunden hatte keinen weiteren Einfluß auf die CAR1 -mRNA-Expression. Die im Gehirn, in der Skelettmuskulatur, im Herzen und bedingt in der Niere während der embryonalen und neonatalen Entwicklung sowie in Rattenkardiomyozyten mit geringer Zelldichte und entsprechend geringen Zellkontakten ermittelte höhere rCAR-mRNA-Expression ist ein wichtiger Hinweis dafür, dass CAR eine Bedeutung bei der Organentwicklung hat, in deren Rahmen CAR wahrscheinlich als Zelladhäsionsmolekül fungiert und am Aufbau von Zellkontakten (ýPfadfinderý-Funktion) beteiligt ist. Die unter Verwendung eines hCAR-exprimierenden Vektors durchgeführten Untersuchungen an neonatalen Rattenkardiomyozytenkulturen konnten deutlich machen, dass die CAR-Expression auch in Kardiomyozyten die Effizienz der AdV- Aufnahme und somit die Gentransfereffizienz entscheidend beeinflusst. So führte die Expression von rekombinantem hCAR auf der Zelloberfläche sowohl zu einer erhöhten AdV-Bindung als auch zu einer erhöhten AdV-Aufnahme und Transgenexpression.

It was the aim of this study to investigate the rCAR1- and rCAR2-mRNA expression in different organs during peripartal organ development of rats and compare it with the rCAR1- and rCAR2-mRNA expression detected in juvenil and adult rats. In order to get inside into regulation of CAR in the cardial system rCAR1- and rCAR2-mRNA was investigated in neonatal rat cardiomyocytes dependend on cell density and culture time. Finally, impact of CAR for adenoviral gene transfer into cardiomyocytes was investigated by expression of hCAR in cultured neonatal rat cardiomyocytes. The rCAR-isoforms-mRNAs were expressed in all investigated organs. However rCAR2-mRNA expression reached only approximately 10 % of expression of rCAR1-mRNA. However, exclusively in brain, changing of rCAR1- and rCAR2-mRNA expression during organ development was similar. Relative high expression of rCAR2-mRNA in the brain in the early prenatal development indicate that rCAR2 may have a special importance this course of brain development. Additionally investigation should be help to examine this. Especially in brain, skeletal muscle, heart and kidney a stronger rCAR-mRNA expression was detectable during embyonal and peripartal development compare to expression found in juvenil and adult rats as measured by competitive RT- PCR. The decrease was most prominent in brain and skeletal muscle. No significant changes in rCAR1- and rCAR2-mRNA expression were found in the liver and the lung. Investigation of cultured neonatal rat cardiomyocytes demonstrated that rCAR- mRNA was significant higher expressed if cells were seeded at a low density (rCAR1 up to 9.1 fold; rCAR2 up to 2.1 fold) compare to cells seeded at a high density if analyzed 24 hrs after isolation of the cells. Decrease of rCAR-mRNA expression was almost linear. Increasing of culture time for 48 hrs and 72 hrs did not result in further changing rCAR1-mRNA expression. Comparatively high rCAR-mRNA expression in brain, skeletal muscle, heart and kidney during embryonal and neonatal organ development and in cultured neonatal rat cardiomyocytes seeded at low density (result in few cell-cell contacts), indicate that CAR may have importance in organ development, possibly act as a cell adheasion molecule and may be involved in pathfinding for cell-cell contact formation in several organs. Investigation of cultured neonatal rat cardiomyocytes using a hCAR expressing AdV demonstrate that CAR is involved in adenovector attachment and influences over this way the gene transfer efficiency into cardiomyocytes. So it was shown that hCAR expressed on the surface of cardiomyocytes increased adenovector attachment and uptake as well as transgene expression severalfold.