dc.contributor.author
Kleinau, Gunnar
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:11:23Z
dc.date.available
2008-02-27T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10166
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14364
dc.description
DECKBLATT und DANKSAGUNG
TABLE OF CONTENTS p1
COOPERATIONS p6
ABBREVIATIONS p7
1 INTRODUCTION p9
1.1 The Thyroid Stimulating Hormone Receptor p9
1.2 Structural architecture of the TSHR and previously identified inter-/
intramolecular functionalities of extracellular receptor components p11
1.2.1 Extracellular structure of the TSHR p12
1.2.1.1 N-terminal structure p12
1.2.1.1.1 Cysteine-box 1 p12
1.2.1.1.2 Leucine-rich repeat domain p12
1.2.1.1.3 Hinge region p14
1.2.1.1.3.1 Cysteine-box 2 p14
1.2.1.1.3.2 Cysteine-box 2/3 linker p16
1.2.1.1.3.3 Cysteine-box 3 p18
1.2.1.2 Extracellular loops p18
1.2.1.2.1 Extracellular loop 1 p18
1.2.1.2.2 Extracellular loop 2 p19
1.2.1.2.3 Extracellular loop 3 p19
1.2.1.3 TSH - TSHR interaction p20
1.2.1.4 Molecular Models of the GPHRs p21
1.2.1.4.1 LRR domain p21
1.2.1.4.2 Receptor models including extracellular loops and the hinge region
p22
1.3 Activation and Inactivation of the TSHR p22
1.3.1 Activity states of the TSHR p22
1.3.2 Phenotypes of Mutations p24
1.3.2.1 Constitutively activating mutations p24
1.3.2.2 Inactivating mutations p25
1.3.2.3 Databases of mutation phenotypes p25
1.3.2.4 Modulation of TSHR activity by low molecular weight ligands p26
1.4 Aims of the studies p26
1.5 Strategy p27
2 MATERIAL AND METHODS p30
2.1 Bioinformatics, Molecular Modelling and Docking Procedures p30
2.1.1 Amino acid sequence alignment of the GPHRs p30
2.1.2 Molecular modelling of TSHR and LHCGR; LMW ligand docking procedures p30
2.1.2.1 The serpentine domain of TSHR and LHCGR p30
2.1.2.2 Cysteine-box 1 and the leucine-rich repeat hormone binding domain p31
2.1.2.3 Cysteine-box 2 and cysteine-box 3 p32
2.1.2.4 S281 at cysteine-box 2 and the extracellular loop 1 p32
2.1.2.5 Extracellular loop 2 and 3 p33
2.1.2.6 Docking complexes of the TSHR and the LHCGR with a LMW ligand p33
2.1.3 Sequence-Structure-Function resource p34
2.1.3.1 Data Set p34
2.1.3.2 Alignment p34
2.1.3.3 Numbering p35
2.1.3.4 3D models and structural templates for GPHR models p35
2.1.3.5 Database Technology p36
2.1.3.6 Search functions and Output options p36
2.2 Characterization of mutant phenotypes p37
2.2.1 Site-directed mutagenesis p37
2.2.2 Cell culture and transient expression of mutated TSHRs p38
2.2.3 FACS analyses p38
2.2.4 cAMP accumulation assay p38
2.2.5 Stimulation of inositol phosphate formation p39
2.2.6 Linear regression analysis of constitutive activity as a function of
TSHR expression (slopes) p39
2.2.7 Confocal laser scanning microscopy (CLSM) p39
2.2.8 Statistics p40
3 RESULTS p41
3.1 Molecular analysis of receptor components p41
3.1.1 Cysteine-box 1 and the leucine-rich repeat hormone binding domain p41
3.1.1.1 Molecular Model p41
3.1.2 Structural model and functionalities of cysteine-boxes 2 and 3 p44
3.1.2.1 Molecular models of C-b2 and C-b3 complexed with the LRRD p44
3.1.2.2 Functional characterization of amino acids p48
3.1.2.2.1 Mutations of residues in cysteine-box 2 p48
3.1.2.2.2 Mutations of residues in cysteine-box 3 p49
3.1.3 Extracellular loop 1 and the interaction with cysteine-box 2 p53
3.1.3.1 Molecular Model p53
3.1.3.2 Functional characterization of amino acids p54
3.1.3.2.1 Mutations of S281 in cysteine-box 2 p54
3.1.3.2.2 Functional assessment of the hTSHR mutants at Y279 (C-b2),Y476,
H478, Y481, Y482, and H484 (ECL1) p56
3.1.4 Extracellular loop 2 p58
3.1.4.1 Molecular Model p58
3.1.4.2 Functional characterization of amino acids in the ECL2 p60
3.1.4.3 Identification of amino acids that are involved in the constitutive
activation caused by pathogenic mutation I568V p62
3.1.5 Extracellular loop 3 p65
3.1.5.1 Molecular Model p65
3.1.5.2 Functional characterization of amino acids in the ECL3 p67
3.2 Modes of binding of a small agonistic molecule p69
3.2.1 Molecular models of the TSHR and the LHCGR in complex with a LMW agonist
p69
3.3 A semi-quantitative data set for Sequence-Structure-Function Analysis at
GPHRs p74
3.3.1 Data Set p74
3.3.2 SSFA Tools p75
3.3.3 Pathogenic mutations p79
3.3.4 Constitutively activating mutations p79
4 DISCUSSION p80
4.1 A tightly packed signalling interface between the extracellular-and the
serpentine domain p80
4.1.1 Structural-functional features of the N-terminal cysteine-box 1 and the
LRR hormone binding domain p80
4.1.2 The LRRD is oriented in spatial proximity to the serpentine domain and
linked via cysteine-box 2 p82
4.1.3 Epitopes Y279-K291 of cysteine-box 2 and P400-D410 of cysteine-box 3 are
localized at the interface between the ecto- and serpentine domain p82
4.1.4 Intramolecular switches for signalling activity in the TSHR ectodomain
p83
4.1.4.1 Signalling sensitive amino acids in cysteine-box 3 p83
4.1.4.2 Constitutively activating mutations in cysteine-box 2 p85
4.1.5 Modulation of signalling activity by mutations of amino acids in
cysteine-box 2 and cysteine-box 3 p86
4.1.6 Section summary p89
4.2 A fundamental role of the extracellular loop 2 in the signal transduction
process p90
4.2.1 Lysine 565 in the ECL2 is a key player in the intramolecular signalling
processes of the TSHR p90
4.2.2 Mutations with both decreased basal Gas- and decreased hormone-induced
Gaq activity p90
4.2.3 The interface between the ECL2 and the TMH6 p91
4.2.4 TMH6 may glide along the ECL2 according to different receptor activity
states p93
4.2.5 Section summary p95
4.3 The extracellular loop 3 is of high functional importance p95
4.3.1 A hydrophobic cluster in the center of the third extracellular loop is
important for TSH receptor signalling p96
4.3.2 Section summary p97
4.4 TSHR activation by a low molecular weight ligand p97
4.4.1 Modes of binding of a small agonistic molecule p98
4.4.2 Section summary p99
4.5 A Sequence-Structure-Function-Analysis resource p99
4.5.1 SSFA concept and modules p99
4.5.2 SSFA Tools p101
4.5.3 Signalling specificities and interrelated determinants of GPHRs revealed
by SSFAnalysis p103
4.5.3.1 Amino acids of high importance for the conformation of hormone induced
receptor activation p103
4.5.4 Section summary p104
4.6 General importance of presented studies p105
5 SUMMARY p106
ZUSAMMENFASSUNG p109
6 REFERENCES p112
PUBLICATIONS p125
PUBLISHED ABSTRACTS OF POSTERS AND ORAL PRESENTATIONS p126
ERKLÄRUNGEN p128
dc.description.abstract
The glycoprotein-hormone receptors (GPHRs), thyroid stimulating hormone (TSH,
thyrotropin) receptor (TSHR), lutropin (LH)/ choriogonadotropin (CG) receptor
(LHCGR) and follitropin (FSH) receptor (FSHR) are related members of the
rhodopsin/adrenergic receptor family within the GPCR superfamily. TSH and the
TSHR are pivotal proteins in the control of thyroid function. The TSHR is
activated by TSH, however it can also be activated by constitutively
activating mutations (CAMs), antibodies, small synthetic ligands, tryptic
cleavage and deletions of epitopes in the extracellular domain (ECD) or the
serpentine domain (SD). Dysfunction of the TSHR causes several diseases
including hyper- and hypothyroidism. Therefore, the delineation of the
molecular activation mechanism by investigation of sequence-structure-function
relationships in the TSHR is of high importance to understand the molecular
causes of frequently occurring receptor dysfunctions. Moreover, knowledge
about structural localization and biochemical/biophysical properties of
signalling sensitive amino acids or specific epitopes regarding inactivation
or activation of the TSHR will allow better understanding of the complex
activation mechanism and reveal new ideas of sites for pharmacological
interventions. This might open the door for new therapeutic perspectives for
treatment of TSHR-mediated diseases with the TSHR as a direct target. The aim
of this study was to provide conceptual progress in the understanding of how
glycoprotein hormone receptors convey the signal from the externally bound
hormone towards the transmembrane domain in order to achieve the transition
between the basal and active conformations. The detailed aims were: i)
structural and functional characterization of determinants that are
prerequisites for the signal transduction process, ii) molecular description
of localization and binding-modes of small molecules, iii.) generation of a
sequence-structure-function analysis resource for phenotypes of GPHRs. Using
an iterative cycle of hypothesis and experimental proof of sequence-structure-
function relationships by combining molecular homology modeling and site
directed mutagenesis, the border between physiological and structural aspects
is crossed by confirming predictions of molecular and structural determinants
for TSHR activation. In these studies structural features of the leucine-rich
repeat hormone binding domain (LRRD) were described and for the first time
provided deep and important insights in the structural architecture of this
special receptor domain that is responsible for the hormone and antibody
binding process. It was shown, that the LRRD is comprised of eleven leucine-
rich repeats instead of the formerly predicted nine repeats. Homology models
predicted a structure and shape of the LRR domain that is completed by the
flanking cysteine boxes as stabilizing portions of the LRRD. This shape and
structure was later on confirmed by the published crystal structure of the
FSHR LRRD. This information shed new light on the extracellular inter- and
intermolecular interactions of GPHRs. Furthermore, assembled comparative
models led to the identification of new epitopes at the structurally unknown
hinge region that are essential for the activation process. In detail, the
hypothesis was developed that portions of the intramolecular components at
cysteine-boxes C-b2 and C-b3 in the N- and C-terminal extracellular hinge
regions interact in tight spatial cooperation and are localized at the
interface between the ecto- and serpentine domains. As one major result,
modeling driven mutagenesis studies showed that these structural features are
of high significance in the primary and/or secondary activation steps of TSHR.
Point mutations led on the one hand to the identification of 5 new positions
in the TSHR for constitutive receptor activation by mutations (C-b2: K291A;
C-b3: D403A, E404K, N406A, P407D) that stabilise the basal receptor state. On
the other hand inactivating mutations for TSH mediated signaling (P400A,
P407A, E409A) were identified and provided new hints for components involved
in the formation of the activated receptor state. Considering the spatial
proximity of these portions, they very likely form components of an
intramolecular structural switch (internal transmitter) which is important for
the stabilization of the basal, partially active state of TSHR as well as the
signal transduction from the ectodomain towards the serpentine domain.
Additionally, several mutations in the ECL2 (K565A), and the ECL3 (P652A-
V656A), led to inactivation of the TSHR (also selective for different
G-protein subtypes), suggesting that these extracellularly located amino acids
are important for the transduction of the signal from the ectodomain to the
transmembrane domain by initiating the coupling of the hormone to the ECD. The
second major result is the identification of a molecular hydrophobic contact
site and interface between the ECL2 and the TMH6 of the TSHR. This functional
interface is most probably involved in triggering different activity states
and the subsequently conformational adjustment of TMH6 by ECL2. In detail, the
isoleucines 640 in TMH6 and 568 in ECL2 were identified and characterized as
complementary knob and hole counterparts and key players in the TSHR signaling
process. Slight side chain alterations at both positions by site-directed
mutagenesis lead to a decreased or increased basal activity, which confirmed
the predicted mutual shift. This result confirmed the fundamental rule of TMH6
movement for different activity states of a GPCR. Moreover, the rule is
augmented by identifying a regulating counterpart at ECL2 in the case of the
TSHR. Taken together, this study identifies several intramolecular signaling
determinants of the extracellular region of TSHR that can be functionally and
structurally described as part of an internal signaling transmitter. It is
demonstrated, that signaling sensitive interfaces and molecular contacts
between structural receptor components (e.g. between ECL2 and TMH6) are
important for the modulation of activity states of the TSHR. Moreover, based
on the refined molecular models, docking studies are also conducted for a
small molecular weight ligand (LMW) that activates the TSHR and the homologous
LHCGR. This study describes allosteric binding modes of a LMW ligand to the
TSHR and LHCGR in detail. Molecular localization, direct interactions between
the LMW ligand and TSHR are suggested and confirmed. This information is a
prerequisite for the rational development and refinement of highly potent LMW
ligands (antagonistic and agonistic). Finally, a web accessible resource
system for Sequence-Structure-Function Analysis (www.fmp-berlin.de/ssfa) was
developed for GPHRs using functional data from about 900 mutations.
Complementary to known databases, the data set and developed tools allow the
linking of functional and biochemical properties of wild type and mutation
phenotypes of GPHRs with spatial features to reveal structure-function
relationships. Moreover, a semi-quantitative analysis allows a discrimination
of molecular and structural determinants that are responsible for different
functionalities such as selective G-protein-mediated activation of GPHRs.
de
dc.description.abstract
Die Rezeptoren des schilddrüsenstimulierenden Hormons (TSHR), des Lutropins/
Chorioganadotrophins (LHCGR) und des Follitropins (FSHR) sind homologe
Mitglieder der Rhodopsin-ähnlichen Rezeptorfamilie innerhalb der Superfamilie
der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Die Hormone sind Glykoproteine
(GPHs), und demzufolge werden ihre Rezeptoren als Glykoprotein-Hormon
Rezeptoren bezeichnet (GPHRen). Das schilddrüsenstimulierende Hormon und
dessen Rezeptor sind Schlüsselproteine in der Kontrolle der
Schilddrüsenaktivität. Fehlfunktionen des TSHR, hervorgerufen durch Mutationen
oder autoimmune Reaktionen, sind Auslöser für Schilddrüsenunter- oder
Überfunktion. Die Aufklärung des Aktivierungsmechanismus des TSH-Rezeptors
durch Untersuchungen von Sequenz-Struktur-Funktionsbeziehungen, ist für das
Verständnis von molekularen Ursachen häufig auftretender pathogener
Fehlfunktionen von elementarer Bedeutung. Insbesondere sind hierbei die
Identifizierung und Charakterisierung von signalsensitiven Aminosäuren oder
Proteinabschnitten im Bezug zu Aktivierung wie auch Inaktivierung essentiell.
Der generelle Nutzen soll letztendlich darin liegen, neue therapeutische
Perspektiven für die pharmakologische Intervention von Schildrüsenerkrankungen
erstmals direkt am TSH-Rezeptor, d.h., direkt an der molekularen Ursache zu
eröffnen. Bisher waren nur Fragmente zum Aktivierungsmechanismus des TSHR
bekannt. Das Ziel dieser Studien war es daher auch, konzeptionelle
Fortschritte für ein tieferes molekulares Verständnis zu entwickeln, wie ein
Signal nach der extrazellulären Bindung des Hormons von der Ektodomäne auf die
Transmembrandomäne übertragen wird, um den Übergang zwischen basaler und
aktiver Konformation des Rezeptors zu induzieren. Die spezifischen Ziele
hierbei waren: i.) Identifizierung und funktionelle/strukturelle Beschreibung
von signalsensitiven Determinanten, welche direkt involviert sind in die
Modifizierung verschiedener Rezeptorkonformationen, ii.) die Beschreibung von
Lokalisation und Bindungsmodi kleiner Moleküle im TSHR und LHCGR, iii.) die
Generierung einer Datenbank für die Sequenz-Struktur-Funktionsanalyse an den
GPHRen. Dafür wurden durch einen iterativen Zyklus von homologer
Strukturmodellierung (Hypothese) und ortsgerichteter Mutagenese
(experimentelle Überprüfung) die strukturellen und physiologischen Aspekte
miteinander verbunden. In dieser Arbeit werden neue strukturelle Details und
daraus resultierende wichtige Aspekte der generellen Architektur für die
Leucin-reiche repetitive Hormonbindungsdomäne (LRRD) vorgestellt. Unter
Verwendung von Homologiemodellierung wurden zwei zusätzliche repetetive
Struktureneinheiten zu den bisher neun angenommenen vorgeschlagen, sowie eine
N- und C-terminale Begrenzung zur Faltungsstabilisierung durch Cystein-reiche
Regionen. Sowohl die Vorschläge zu detaillierten Strukturmerkmalen als auch
zur generellen Faltung der LRRD wurden im Nachhinein durch eine
veröffentlichte Kristallstruktur der LRRD des FSH-Rezeptor bestätigt.
Weiterhin wurde ein Teil-Modell der extrazellulären Hinge-Region erarbeitet,
welche die LRRD mit der Transmembrandomäne verbindet. Dieses Modell führte zur
Identifizierung eines neuen, signalrelevanten Epitops am TSH-Rezeptor. Hierbei
wurde die Hypothese entwickelt, dass die N- und C- terminalen Cystein-reichen
Komponenten (Cystein-Box 2 und 3) der Hinge-Region in engster räumlicher
Nähe zueinander lokalisiert sind und eine funktionale Schnittstelle zwischen
extrazellulärer und transmembranaler Domäne darstellen. Durch daraus
resultierende Mutagenesestudien konnte gezeigt werden, dass diese
strukturellen Determinanten tatsächlich für die primären bzw. sekundären
Aktivierungsschritte des TSHR von wesentlicher Bedeutung sind. Punktmutationen
führten einerseits zu 5 neuen Aminosäurepositionen mit konstitutiver
Rezeptoraktivierung (Cystein-Box 2: K291A; Cystein-Box 3: D403A, E404K, N406A,
P407D). Andererseits wurden 3 neue inaktivierende Mutationen charakterisiert
(P400A, P407A, E409A), welche Hinweise auf intramolekulare Komponenten
darstellen, die in die Formation einer aktiven Rezeptorkonformation involviert
sind. Diese signalrelevanten Aminosäuren sind sehr wahrscheinlich Bestandteile
eines internen Signaltransmitters, welcher sowohl für die Stabilisierung der
basalen als auch für die (partial) aktivierte Konformation und damit
potentiell für die Signalweiterleitung zwischen der Ektodomäne und der
Transmembrandomäne des TSHRs eine wichtige Rolle spielt. Ein weiterer Fokus
dieser Arbeit liegt auf der Untersuchung der extrazellulären Loops (ECLs).
Zahlreiche Mutationen in den extrazellulären Loops 2 (K565A) und 3 (P652A-
V656A) führten zur Inaktivierung des TSHR. Diese extrazellulär lokalisierten
Aminosäuren sind als wichtig für den Signalisierungsprozeß und die
G-Proteinaktivierung durch den Rezeptor anzusehen. Außerdem ist die
Identifizierung eines direkten Kontaktes zwischen hydrophoben Aminosäuren des
extrazellulären Loop 2 und der Transmembranhelix 6 (TMH6) ein weiteres
Hauptergebnis der vorliegenden Arbeit. Im Einzelnen wurden die Isoleucine 568
des ECL2 und 640 der TMH6 als komplementäre Gegenspieler identifiziert, die
direkt miteinander interagieren und eine Schlüsselstellung im
Signalisierungsprozess innehaben. Kleinste Seitenkettenveränderungen an beiden
Positionen führen entweder zu einer Absenkung oder zur Anhebung der
Signalisierungsaktivität des TSHR. Dies läßt sehr wahrscheinlich auf eine
spezifische konformationelle Verschiebung der Komponenten zueinander
schließen. Dieser identifizierte Kontakt stellt ebenfalls eine funktionale
intramolekulare Schnittstelle im TSHR dar und ist in die Steuerung
verschiedener Konformationen des TSHR involviert. Dieses Resultat bestätigt
auch, dass im TSHR die Translokation der TMH6 eine zentrale Rolle für
verschiedene Aktivitätszustände spielt. Als weiterer Punkt dieser Arbeit wurde
die Interaktion kleiner Liganden am TSHR und LHCGR untersucht. Basierend auf
den molekularen Strukturmodellen sind Dockingstudien für kleine aktivierende
Substanzen an diesen Rezeptoren durchgeführt worden. Diese beschreiben
erstmals detailliert allosterische Bindungsmodi kleiner Moleküle in TSHR und
LHCGR. Die vorgeschlagene Lokalisierung und postulierte Interaktionen im
transmembranalen Raum zwischen Rezeptor und Ligand konnten experimentell
verifiziert werden. Diese Informationen bilden eine rationale Basis für die
Weiterentwicklung von aktivierenden und inaktivierenden synthetischen
Liganden. Parallel zu diesen Studien wurde ein Internet-basiertes
Informationssystem geschaffen (www.fmp-berlin.de/ssfa). Am Rezeptor-Wildtyp
kalibrierte Funktionsdaten von 900 publizierten Mutationsphenotypen der GPHRen
sind hier unter anderem mit räumlichen Strukturdaten verknüpft worden und
ermöglichen damit semiquantitative Sequenz-Struktur-Funktionsanalysen.
Komplementär zu bekannten Mutationsdatenbanken sind differenzierbare
Suchstrategien für die Aufdeckung von Struktur-Funktionszusammenhängen
implementiert. Das erlaubt eine gezielte Extraktion von funktional wichtigen
Rezeptorkomponenten, wie z.B. Determinanten selektiver G-Proteinkopplung oder
die bereits erwähnten Schnittstellen der Signalübertragung. Zusammengefasst,
die hier vorgestellten Arbeiten geben einen erweiterten detaillierten Einblick
in die Signalisierungsmechanismen des TSH-Rezeptors durch die Identifizierung
und Beschreibung von Struktur-Funktionsbeziehungen involvierter molekularer
Determinanten.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Thyrotropin receptor
dc.subject
Activation mechanism
dc.subject
Signal transduction
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Molecular Analysis of Extracellular Structures and Functionalities of the
Thyroid Stimulating Hormone Receptor
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hartmut Oschkinat
dc.contributor.furtherReferee
Prof Dr. Volker Haucke
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. U. Heinemann, Prof. Dr. Koksch, Prof. Dr
dc.date.accepted
2008-02-14
dc.date.embargoEnd
2008-03-07
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000003434-8
dc.title.translated
Molekulare Analyse extrazellulärer Strukturen und Funktionen des Schilddrüsen-
stimulierenden Hormon Rezeptors
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000003434
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2008/166/
refubium.mycore.derivateId
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