Methodische Arbeiten zur Entwicklung verbesserter Enzymaktivitätsbestimmungen von Xylanasen und Glucanasen in komplexen Proben (Futtermitteln und Digesta)

Abstract

Die in der Tierernährung zur besseren Verwertung pflanzlicher Futtermittel durch landwirtschaftliche Nutztiere verwendeten Futterzusatzenzyme (Xylanasen u. 1-3,1-4- β -Glucanasen) unterliegen den gleichen Anforderungen wie alle Futterzusatzstoffe. Enzymaktivität wird über die Wirkung auf spezifische Substrate bestimmt. Nachweisempfindlichkeit und Meßbereich schwanken wegen der verschiedenen Eigenschaften natürlicher Substrate und den biochemischen Charakteristika der Enzyme. Physikalisch, chemisch und biologisch modifizierte Substrate wurden in den Aktivitätsbestimmungsmethoden eingesetzt. Die Futterzusatzenzympräpate Avizyme 1300® (T. longibrachiatum, T. viride), Biofeed plus® (H. insolens), Biofeed Wheat® (A. oryzae), Lyxasan® (A. niger I), Roxazyme® (T. viride), Barlican® (T. reesei I), Biopract® (T. reesei II), Energex® (A. niger II), Novozyme 104® (k.a.), und Hostazym X® (k.a.) wurden charakterisiert. Bis auf Biofeed Wheat ® bestehen alle Präparate aus einem Enzymgemisch mit unterschiedlichem isoelektrischen Punkt, pH-Optimum, etc. Jedes Präparat zeigt eine von der Enzymkonzentration unabhängige unterschiedliche Verteilung der Hydrolyseprodukte, welche die Aktivitätsbestimmungen beeinflußt. Für jedes Enzympräparat muß eine eigene Kalibrationsreihe aufgenommen werden. Chromogene Substrate sind Xylane oder β: -Glucane (ultraschallbehandelt, carboxymethyliert, autoklaviert, unbehandelt) mit kovalent oder ionisch gebundenem Farbstoff. Die Hydrolyse setzt ionisch gebundenen Farbstoff bzw. Hydrolyseprodukte mit kovalent gebundenem Farbstoff frei. Die in dieser Arbeit hergestellten Präparate hatten gegenüber den kommerziellen Präparaten keinen Vorteil. Ultraschallbehandeltes Haferspelzenxylan ermöglicht die Xylanaseaktivitätsbestimmung über die Viskositätsabnahme der Substratlösung ohne die Messung der Anfangsviskosität, da das anfängliche Ansteigen der Viskosität nach der Enzymzugabe entfällt. Im Agardiffusionstest wird enzymhaltige Lösung in den Löchern einer substrathaltigen Agarplatte (Xylan, β -Glucan) inkubiert und diese mit Kongorot angefärbt, hydrolysiertes Substrat ist durch helle Lysezonen zu erkennen. Der Meßbereich und die Detektionsempfindlichkeit wurde durch Verwendung modifizierter Substrate (Ultra­schall- u. Autoklavbehandlung) und den Einsatz eines Photodokumentationssystems verbessert. In der neuen Methode Farbreaktion wurde Substrat mit Enzympräparat inkubiert und mit dem Farbstoff Reaktivgrün umgesetzt. In Natriumacetatpuffer konnten Enzymaktivitäten bis zu 0,005 IE/ml, in Futtermittelextrakt bis 0,05 IE/ml bestimmt werden.

Feed additive enzymes are used in animal nutrition for better utilization of animal diets. As all other feed additives, xylanase and/or (1-3,1-4)- β -glucanase enzymes must be detectable in animal feed. The activity of non starch polysaccharide degrading enzymes can be detected by hydrolysation of specific substrates. The detection limit and -range depend on substrate characteristics and the biochemical characteristics of active enzymes. To increase the detection limit substrates were physically, chemically and biologically modified and tested. The commercial enzyme preparations Avizyme ® 1300 (T. longibrachiatum, T. viride), Biofeed plus ® (H. insolens), Biofeed Wheat ® (A. oryzae), Lyxasan ® (A. niger I), Roxazyme ® (T. viride), Barlican ® (T. reesei I), Biopract ® (T. reesei II), Energex ® (A. niger II), Novozyme 104 ® (no declaration), and Hostazym X ® (no declaration) were purified, their activities and substrate specificities determined. They contained at least two xylanase activities except Biofeed Wheat ® . The enzyme preparations consisted of mixtures of different enzymes, differing in isoelectric point and pH behaviour. The analysis of hydrolytic products showed a profile for each enzyme preparation which was independent from the enzyme concentration. The different distribution of hydrolytic products influenced the activity estimations. Thus, it is generally necessary to generate a separate calibration curve for each enzyme preparation. Chromogenic substrates were xylans or β -glucans, ionically or covalently coupled with a dye. The enzymatic hydrolysation frees the ionic dye or produces hydrolytic products with covalent coupled dye. Different dyes (covalently or ionically coupled) and different substrates (ultrasonicated, autoclaved, carboxymethylated) were combined and tested in enzyme assays. These preparations were not superior to commercial preparations. Ultrasonicated oat spelt xylan allowed the xylanase activity to be measured as viscosity reduction without measuring the initial viscosity of the substrate solution, because no initial increase of the viscosity was observed after addition of enzyme. In an agar diffusion assay enzyme solutions were incubated in wells of an agar plate containing substrate. The plate was stained with congo red. Congo red is bound by highmolecular polysaccharide. Enzymatic hydrolysis is shown after red staining as clear lysis zones. The range and detection limit was improved using modified substrates (ultrasonicated or autoclaved) and a digital photodocumentation system. The dye reaction is a new method for the determination of xylanase activities. Soluble ultrasonicated oat spelt xylan was hydrolysed and hydrolytic products bound reactive green. In sodium acetate buffer the detection limit of enzyme activity was 0.005 IE/ml, in feed stuff extract about 0.05 IE/ml.