Validation of three diagnostic techniques to diagnose subclinical endometritis in mares

Abstract

Endometritis in the mare still constitutes a great problem in the management of broodmares. Inflammatory processes of the equine uterus can be classified as acute, chronic or subclinical endometritis. All these conditions may cause substantial reductions of a mare’s fertility. In recent years the problem of subclinical inflammatory processes with hidden or subtle clinical signs became more obvious. Although several diagnostic methods such as rectal palpation, transrectal ultrasonography, vaginal examination, uterine culture, cytology or endometrial biopsy are available, the correct diagnosis of subclinical endometritis challenges practitioners in the field. Therefore, the overall objective of this study was to evaluate the ability, the reliability and the representativeness of the commonly used diagnostic techniques endometrial swab, cytological brush and endometrial biopsy to diagnose subclinical endometritis in mares. In the first study bacteriological, cytological and histological samples were taken from 55 mares without clinical signs of endometritis. A double-guarded uterine swab (US), a singleguarded cytological brush (CB) and an endometrial biopsy (EB) were taken consecutively under manual control, smeared on microscopic slides for cytological examination and cultured for bacterial growth. Additionally, endometrial biopsy samples were evaluated for polymorphonuclear neutrophils (PMN) in the stratum compactum by a histopathological institute. Bacteriological cultures and cytological samples were classified as negative (no uterine pathogens in monoculture; < 2% PMN) or positive (uterine pathogens in > 90% of the grown colonies; > 2% PMN) for endometritis. Uterine pathogens were found in 20.0% of the mares. Isolation of pathogens was not associated with positive cytological findings (r = ´0.23; p = 0.87). Two of five mares infected with Streptococcus zooepidemicus had a positive cytological result. In contrast, none of the six mares with an Escherichia coli infection showed a positive cytological result. The histological presence of PMN in the stratum compactum of the endometrium is commonly accepted as 'best standard' to diagnose endometritis in mares. Compared to the 'best standard', sensitivity of cytology of CB, US and EB was 0.17, 0.00 and 0.25, respectively. Sensitivity of uterine culture was 0.25, 0.33 and 0.25 for CB, US and EB, respectively. Cytology in combination with a bacteriological examination of a cytological brush sample resulted in the best sensitivity of 0.42. Based on this result, a combination of a bacteriological and a cytological examination of a cytological brush sample can be recommended as an easy to perform technique to improve the diagnosis of subclinical endometritis in the field compared to the uterine culture as currently used routine method alone. The objective of the second study was to determine the distribution of PMN within different sampling locations of the equine uterus by cytological and histological examinations and to compare PMN numbers of the two techniques at the corresponding locations. We hypothesized that one sample of either method would represent the actual health status of the whole uterus and that PMN numbers correlate between the methods. Cytological and endometrial biopsy samples were taken in vitro from 37 uteri within 2 ± 1 h after slaughter from five pre-defined locations of each uterus. Cytological samples were smeared on microscopic slides, stained and classified as negative (< 2% PMN) or positive (≥ 2% PMN) for endometritis. Histologically, the number of PMN were counted by an experienced pathologist (≥ 5 PMN/3 high power fields in 40 x magnification = positive for endometritis) and grades of endometrosis ('-' to '+++') and angiosclerosis ('-' to '+++') were evaluated. The prevalence of positive cytological and histological samples was 14.6% and 17.8%, respectively. A fair agreement between the two diagnostic methods could be detected (k = 0.29; p < 0.01). A whole uterus was defined as positive for endometritis when at least one of the five sampled locations was scored as positive for the counts of PMN. A total of 10 and 14 uteri generally positive for endometritis could be detected in cytological and histological examination, respectively. Numbers of PMN differed between the sampling locations resulting in positive and negative locations within the positive uteri, in both, cytological (8/10) and histological examination (13/14). Nevertheless, significant differences of endometritis positive or negative scores within the different locations could not be detected, neither in cytological (p = 0.56) nor in histological examinations (p = 0.1). Additionally, no significant differences in classification of endometrosis (p = 0.96) and angiosclerosis (p = 0.67) within the locations could be observed. In conclusion, inflammatory processes are not spread uniformly within the endometrium. Also, the hypothesis that PMN numbers correlate between the two diagnostic methods at a chosen location has to be rejected. Further research is warranted to determine the optimal number of sampling locations in cases of different types of endometritis while maintaining practical feasibility. Overall, this thesis clearly showed that a single bacteriological or a single cytological examination of the uterus might produce false negative results to identify subclinical endometritis in mares. This might be due to the inhomogenous distribution pattern of PMN within the endometrium. And because of this, the prognostic category according to Kenney and Doig (1986) could also change within one uterus. Therefore, the results of all tested diagnostic techniques should be critically evaluated for the prediction of a mares fertility. The combination of a bacteriological and a cytological examination of the cytological brush is the most easy and promising approach for diagnosing subclinical endometritis in the field. Further research is needed to determine whether the combination of two diagnostic techniques or multiple sampling of the endometrium might improve the reliability of the diagnosis of subclinical endometritis in the mare.

Die Endometritis spielt im Management von Zuchtstuten eine sehr bedeutende Rolle. Entzündliche Prozesse können in akute, chronische oder subklinische Endometritiden unterteilt werden. Jede dieser Veränderungen kann die Fruchtbarkeit der betroffenen Stute erheblich negativ beeinflussen. In den letzten Jahren hat das Problem der subklinischen Endometritis mit ihren fehlenden oder nur im geringen Ausmaß vorhandenen klinischen Anzeichen mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Obwohl es einige diagnostische Möglichkeiten wie rektale Palpation, transrektaler Ultraschall, vaginale Untersuchung, Uterustupfer, -zytologie und -biopsie gibt, ist es für den Praktiker dennoch schwierig die subklinische Endometritis zu diagnostizieren. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die drei etablierten diagnostischen Methoden Uterustupfer, -zytologie und -biopsie auf ihre Fähigkeit, ihre Verlässlichkeit und ihre Wiederholbarkeit bei der Diagnose von subklinischen Endometritiden zu testen. In der ersten Studie wurden dazu je eine Tupfer-, eine Zytologie- und eine Biopsieprobe aus dem Uterus von 55 Stuten, die keine klinischen Anzeichen einer Endometritis zeigten, genommen. Die Proben wurden mit einem doppelt behüllten Uterustupfer, einem einfach behüllten Zytologiebürstchen und einer Biopsiezange entnommen. Danach wurden sie zuerst für die zytologische Auswertung auf sterilen Objektträgern und anschließend auf entsprechenden Nährmedien ausgestrichen, um auch das bakterielle Wachstum beurteilen zu können. Zusätzlich zu den bereits genannten Untersuchungen wurden in den Biopsieproben die Anzahlen an neutrophilen Granulozyten (PMN) im Stratum compactum des Endometriums durch ein pathologisches Institut bestimmt. Die bakteriologischen und zytologischen Proben wurden entweder in 'Endometritis negativ' (keine pathogenen Keime in Monokultur; < 2% PMN) oder in 'Endometritis positiv' (pathogene Keime in > 90% des Wachtums; > 2% PMN) eingeteilt. Pathogene Keime wurden in 20% der Stuten gefunden. Positive Ergebnisse in der Zytologie waren nicht mit einem gleichzeitigen Auftreten von pathogenen Keimen verbunden (r = -0,23; p = 0,87). Zwei von fünf Stuten, die mit Streptokokkus zooepidemicus infiziert waren, zeigten ein positives zytologisches Ergebnis. Die sechs Stuten, die mit Escherichia coli infiziert waren, wiesen hingegen allesamt kein positives zytologisches Ergebnis auf. Das Vorkommen von PMN im Stratum compactum des Endometriums ist bei der Stute als der 'best standard' zur Diagnose von Endometritiden akzeptiert. Bezogen auf den 'best standard' erreichten die Zytologieproben von Tupfer, Zytologiebürstchen und Biopsie eine Sensitivität von 0,17, 0,00 und 0,25. Bei der Auswertung der Bakteriologie erreichten Tupfer, Zytologiebürstchen und Biopsie eine Sensitivität von 0,25, 0,33 und 0,25. Die beste Sensitivität (0,42) wurde durch die Kombination von zytologischer und bakteriologischer Auswertung eines Zytologiebürstchens erreicht. Im Vergleich zu der bisherigen Routineuntersuchung des Tupfers zeigt dies, dass die kombinierte zytologische und bakteriologische Auswertung eines Zytologiebürstchens empfohlen werden kann. Die Diagnose von subklinischen Endometritiden würde dadurch in der Praxis deutlich verbessert werden. Ziel der zweiten Studie war es, die Verteilung von PMN an verschiedenen Stellen in einem Uterus mittels Zytologiebürstchen und Biopsie zu untersuchen und die Anzahl der PMN zwischen den zwei diagnostischen Methoden an der jeweils selben Stelle zu vergleichen. Unsere Hypothesen waren, dass eine einzelne getestete Lokalisation eine verlässliche Aussage für den gesamten Uterus liefern kann, und dass die Anzahl der PMN zwischen den zwei Methoden für jeweils dieselbe Stelle miteinander korreliert. Die zytologischen Proben und Biopsien wurden von fünf vorher definierten Stellen aus 37 Uteri innerhalb von 2 ± 1 h nach der Schlachtung und Entfernung des Uterus aus dem Schlachtkörper entnommen. Anschließend wurden sie auf Objektträgern ausgestrichen, gefärbt und als 'Endometritis negativ' (< 2% PMN) oder 'Endometritis positiv' (≥ 2% PMN) beurteilt. Die Biopsien wurden von einem pathologischen Institut hinsichtlich der Anzahl an PMN (≥ 5 PMN/3 Gesichtsfelder in 40 x Vergrößerung = 'Endometritis positiv') wie auch auf das Vorkommen einer Endometrose und Angiosklerose (Einteilung in Grad '-' bis '+++') ausgewertet. Es wurden in 14,6% 'Endometritis-positive' Zytologieproben und in 17,8% 'Endometritispositive' histologische Proben gefunden. Das ergibt eine mäßige Korrelation von k = 0.29 (p < 0.01). Ein Uterus wurde im Gesamten als 'Endometritis-positiv' bewertet, sobald einer seiner fünf beprobten Lokalisationen als positiv befunden wurde. Insgesamt wurden in der zytologischen 10 und in der histologischen Auswertung 14 Uteri als 'Endometritis-positiv' bewertet. Die Anzahl an PMN variierte, so dass es innerhalb dieser als 'Endometritis-positiv' befundeten Uteri, sowohl 'Endometritis-positive' als auch 'Endometritis-negative' Lokalisationen gab. Dies war in 8/10 Uteri bei der zytologischen und in 13/14 Uteri bei der histologischen Auswertung eingetreten. Trotzdem konnte, sowohl bei den zytologischen (p = 0,56) als auch bei den histologischen Auswertungen (p = 0,1) kein signifikanter Unterschied bei der Endometritis-Einteilung zwischen den beprobten Lokalisationen gefunden werden. Auch bei den unterschiedlichen Graden von Endometrose (p = 0,96) und Angiosklerose (p = 0,67) konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Diese Studie über die Untersuchung von verschiedenen Lokalisationen zeigt, dass eine entzündliche Veränderung nicht gleichmäßig über das Endometrium verteilt ist. Auch korreliert die Anzahl an PMN bei zwei Untersuchungsmethoden an derselben Lokalisation des Uterus nicht miteinander. Daraus folgt, dass die optimale Anzahl an Proben, abhängig von der Entzündungsform und der Art der Methode, in weiteren Studien noch untersucht werden sollte. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass bei der Diagnose der subklinischen Endometritis sowohl eine einzelne bakteriologische als auch eine einzelne zytologische Untersuchung zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass bei einer vorliegenden Entzündung keine einheitliche Verteilung der PMN vorhanden ist. Dieses kann dann auch zu Veränderungen in der Einteilung in eine der Kategorien nach Kenney und Doig (1986) führen. Die Ergebnisse aller hier getesteten diagnostischen Methoden sollten aus diesem Grund immer kritisch ausgewertet werden. Die kombinierte Auswertung (bakteriologisch und zytologisch) eines Zytologiebürstchens stellt in der Praxis die einfachste und sicherste Methode für eine Diagnose der subklinischen Endometritis dar. Ob entweder eine Kombination von Untersuchungsmethoden oder eine mehrfache Beprobung die größere Verbesserung in der Sicherheit der Diagnose der subklinischen Endometritis bringen kann, sollte in weiteren Studien genauer untersucht werden.