Entwicklung therapeutischer Peptid-Vakzinierung zur Behandlung von Patienten mit hämatopoetischen und soliden Neoplasien

Abstract

Das Immunsystem besitzt die einzigartige Fähigkeit Tumorzellen gezielt zu erkennen und zu zerstören, ohne gleichzeitig normale Körperzellen zu schädigen. Vakzinierungstherapien mit dem Ziel der Induktion einer tumor- spezifischen Immunität stellen daher einen vielversprechenden Ansatz zur Prävention und möglicherweise auch zur Behandlung von Tumoren dar. Im Vorfeld der Entwicklung therapeutischer Vakzinierungen lag der primäre Fokus der hier vorliegenden Arbeit zunächst auf der Evaluation von T-Zellen mit spontaner Reaktivität gegen Tumorzellen und definierte Tumorantigene. Spontane T-Zellen gegen melanomassoziierte Antigene konnten regelmäßig im peripheren Blut von Melanompatienten nachgewiesen werden. Um ein breiteres Spektrum potentieller Tumorantigene zu evaluieren, etablierten wir einen neuen ELISPOT-Assay und untersuchten das Spektrum der spontanen T-Zell-Antwort gegen HLA-gematchte allogene und autologe Tumorzelllinien im peripheren Blut von Patienten mit metastasiertem Melanom. Bei mehr als der Hälfte der Patienten konnten wir IFNγ-freisetzende T-Zellen nach Stimulation mit den allogenen Tumorzelllinien nachweisen. Dabei handelte es sich sowohl um Effektor-, als auch um Memory- CD8+ T-Zellen, die eine HLA-Klasse-I-abhängige T-Zellantwort gegen allogene Tumorzelllinien und bei 4 von 5 Patienten auch gegen autologe Tumorzellen zeigten. Einige der Patienten mit tumorreaktiven T-Zellen zeigten klinische Hinweise für eine möglicherweise immunologisch vermittelte, partielle Tumorkontrolle. Andere hatten progredient wachsende Tumoren, als indirekten Hinweis auf relevante Tumor-Escape-Mechanismen. Diese Beobachtung unterstreicht, dass eine effektive T-Zellimmunität und Tumorüberwachung möglicherweise abhängig ist von der Anwesenheit spezifischer T-Zellen in den Geweben, die von Tumorzellen infiltriert werden. Wir untersuchten daher im Folgenden das Knochenmark als ein Kompartiment, in dem häufig mikrometastatische Tumorzellen vorhanden sind. Nach Stimulation mit dem melanomassoziierten Antigen Tyrosinase und autologen Tumorzellen konnten bei Melanompatienten tyrosinase- und melanomspezifische CD3+, CD8+ T-Zellen im Knochenmark in gleichen oder höheren Frequenzen nachgewiesen werden als im peripheren Blut. Auch hier fanden sich wieder spezifische Effektor- und Memory-T-Zellen, wobei die Frequenzen tyrosinase- und melanomspezifischer Memory-T-Zellen im Knochenmark signifikant höher waren als im peripheren Blut. Im Anschluss an diese grundlegenden Analysen erfolgte die Durchführung einer Pilotstudie einer Tyrosinasepeptid-Vakzinierung bei Patienten mit metastasiertem Melanom in der adjuvanten Situation. Um ein erstes Verständnis der Effektivität einer Peptid-Vakzinierung bei Melanompatienten in einer adjuvanten Krankheitssituation zu erlangen, wurden aus den bisherigen, in unserer Klinik durchgeführten, adjuvanten Peptid-Vakzinierungsstudien alle Melanompatienten identifiziert, die in dem Jahr vor Einschluss in die Vakzinierungsstudie mindestens 3 komplett resizierte Metastasen hatten. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass eine adjuvante Peptid-Vakzinierung bei 4 von 9 Patienten mit einem Sistieren der zuvor wiederholt aufgetretenen Rezidive assoziiert war und dass bei allen 4 Patienten durch die Vakzinierung induzierte T-Zellen ex vivo nachzuweisen waren. In einer weiteren Arbeit wurden diese, durch die Tyrosinase-Peptid-Vakzinierung in Kombination mit GM- CSF und KLH induzierten T-Zellen sowohl im peripheren Blut, als auch im Knochenmark weiter charakterisiert. Wir konnten nachweisen, dass eine Peptid- Vakzinierung mit einem CD8-Epitop und den Adjuvantien GM-CSF und KLH in der Lage ist, eine funktionelle Memory-T-Zellantwort zu generieren, die durch zentrale Memory- und Effektor-Memory-Phänotypen, proliferatives Potential und Knochenmarktropismus charakterisiert ist. Dies steht im Kontrast zu mehreren anderen Vakzinierungsstudien mit HLA-Klasse-I-bindenden Epitopen, die nicht in der Lage waren, zentrale Memory-T-Zellen als Garanten einer langanhaltenden Immunität zu induzieren. Wir vermuten, dass die von uns gewählte Adjuvantienkombination für diese Ergebnisse verantwortlich ist. Der zweite Teil der Arbeit fokussierte auf die Etablierung einer WT1-Peptid-Vakzinierung bei Patienten mit AML und MDS. Als wichtige Vorarbeit konnten wir bei Patienten mit Leukämien erstmals spontane T-Zellen gegen die leukämieassoziierten Antigene Proteinase-3 und WT1 mittels IFNγ-ELISPOT-Assay und durchflusszytometrisch mittels intrazellulärer IFNγ-Sekretion nachweisen. Die Daten deuteten auf eine gute Immunogenität von WT1 und Proteinase-3 bei Patienten mit AML hin und unterstreichen das Potential dieser Antigene für Vakzinierungen bei Leukämien. Gleichzeitig zeigte sich weder bei Leukämiepatienten, noch bei gesunden Kontrollpersonen ein Hinweis auf WT1- oder Proteinase-3-vermittelte, klinisch relevante Autoimmunität. Aufbauend auf diesen Daten wurde in Anlehnung an das erfolgreiche Vakzinierungsprotokoll beim Melanom eine WT1-Peptid-Vakzinierungsstudie mit GM-CSF und KLH als Adjuvantien bei Patienten mit AML und MDS initiiert. Zunächst war völlig unklar, ob die Vakzinierung mit einem einzelnen Peptid bei Patienten mit akuter Leukämie nach Chemotherapie überhaupt immunologische Effizienz haben kann. Überraschend zeigte sich dann aber einerseits eine immunologische Reaktivität, die mit der bei nicht vorbehandelten Melanompatienten vergleichbar war, und andererseits eine überraschende klinische Aktivität, die weitere Untersuchungen rechtfertigt. Inzwischen konnten unsere Ergebnisse von anderen Arbeitsgruppen bestätigt werden und bilden die Grundlage für kommerzielle Vakzinierungsstudien mit einem trunkierten WT1-Protein bei Leukämiepatienten. Essentiell für die Weiterentwicklung von Vakzinierungsstudien ist nun neben der detaillierten immunologischen, molekularen und klinischen Analyse, insbesondere auch die Identifizierung von Immunresistenzmechanismen der Tumorzellen unter dem Druck einer durch Vakzinierungen induzierten Immunantwort. In diesem Zusammenhang konnte in einer, nicht in dieser Arbeit enthaltenen Analyse unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass Defekte der Antigenpräsentation, die entweder durch WT1-Verlust bzw. WT1-Mutationen oder Herunterregulation von HLA-Molekülen bedingt sind, für Immunescape im Rahmen der WT1-Vakzinierung eine untergeordnete Rolle spielen. Eine weitere Arbeit untersuchte bei einer Patientin mit rezidivierender AML, die unter der Vakzinierung eine 12 Monate anhaltende komplette Remission erreichte, die klonale Komposition der durch die Vakzinierung induzierten T-Zellen. Wir konnten damit erstmals eine Evolution und Kompartimentalisierung eines durch eine Peptid-Vakzinierung induzierten T-Zell-Klons im peripheren Blut und Knochenmark eines AML- Patienten dokumentieren. Zum Zeitpunkt des Rezidives zeigte sich derselbe Klon wieder im peripheren Blut, jedoch nicht im Knochenmark, als Hinweis auf eine eingeschränkte Funktionalität. Zusammenfassend konnten wir in dieser Arbeit wichtige immunologische Grundlagenanalysen bezüglich der spontanen und durch Vakzinierung induzierten T-Zell-Immunität bei Melanom- und Leukämiepatienten liefern. Insbesondere konnten wir das Knochenmark als wichtiges immunologisches Organ identifizieren, welches hohe Frequenzen an Memory-T-Zellen beherbergt und eine potentiell wertvolle Ressource für die Generierung von spezifischen Memory-T-Zellen für Vakzinierungen und adoptive Therapiestrategien darstellt. Die Demonstration von immunologischer und klinischer Effizienz der Peptid-Vakzinierungen in Kombination mit GM-CSF und KLH sowohl bei Melanom- als auch bei Leukämiepatienten ist eine wichtige Grundlage für die effektive Weiterentwicklung von Vakzinierungsansätzen. In diesem Zusammenhang ist in Zukunft die weitergehende und konsequente Identifizierung klinisch relevanter Resistenzmechanismen von zentraler Bedeutung.

The immunsystem has the unique ability to recognize and specifically destroy tumor cells without harming normal cells of the body. Vaccine strategies aiming in an induction of a tumor specific immunity represent a promising approach to prevent and also to potentially treat tumors. In preparation of the development of therapeutic vaccinations this work initially focussed on evaluation of T cells with spontaneus activity against tumor cells and defined tumor antigens. Spontaneous T cells against melanoma associated antigens were frequently detected in peripheral blood of melanoma patients. To evaluate a broader spectrum of potential tumor antigens we established a new ELISPOT- assay to analyse the spectrum of spontaneous T cell responses against HLA- matched allogenic and autologous tumor cell lines in peripheral blood of patients with metastatic melanoma. In more than half of the patients we could detect IFNγ secreting T cells after stimulation with allogenic tumor cell lines. These cells were both effector and memory CD8+ T cells, which exhibited an HLA-class-I dependent T cell response against allogenic tumor cells and in 4 out of 5 patients also against autologous tumor cells. Some of the patients with tumor reactive T cells had clinical signs of a potentially, immunologically mediated partial tumor control. Others had progressing tumors, indirectly indicating relevant tumor escape mechanism. This observation underlines the hypothesis that effective T cell immunity and tumor surveillance depends on the presence of specific T cells in tissues, infiltrated by tumor cells. Our next step was therefore the analysis of the bone marrow as a compartment frequently harbouring micrometastatic tumor cells. After stimulation with the melanoma associated antigen tyrosinase and autologous tumor cells we could detect tyrosinase and melanoma specific CD3+, CD8+ T cells in bone marrow in same or higher frequencies than in peripheral blood. Again, these cells were characterized as both specific effector and memory CD8+ T cells, but the frequencies of tyrosinase and melanoma specific memory T cells in bone marrow were significant higher than in peripheral blood. Following these basic analyses we conducted a pilot trial of an adjuvant tyrosinase peptide vaccination in patients with metastatic melanoma. To get a first impression of the efficacy of a peptide vaccination in melanoma patients in the adjuvant setting we identified in all our adjuvant peptide vaccination studies in melanoma patients, all patients with a minimum of 3 completely resected metastases in the year before inclusion into a vaccination trial. We could demonstrate that adjuvant peptide vaccination was associated in 4 out of 9 patients with cessation of before frequently recurrent relapses and that vaccine induced T cells were detectable in all these 4 patients ex vivo. In an additional work these T cells induced by vaccination with tyrosinase peptide in combination with GM-CSF and KLH were further characterized both in peripheral blood as well as in bone marrow. We could demonstrate that a peptide vaccination with an HLA-class-I epitope together with our adjuvants GM-CSF und KLH is able to induce a functional memory T cell response, which is characterized by central memory and effector memory phenotypes, proliferative potential and bone marrow tropism. This is in contrast to other vaccine studies with HLA-class-I binding epitopes, which were not able to induce central memory T cells, as mediator of longterm immunity. We assume, that the adjuvant combination we have chosen might be accountable for these results. The second part of this work focussed on the establishment of a WT1 peptide vaccination in patients with AML and MDS. As important preparatory work we could demonstrate in AML patients spontaneous T cells against proteinase-3 and WT1 by IFNγ ELISPOT assay and by flow cytometry measuring intracellular IFNγ secretion. These data suggest a good immunogenicity of WT1 and Proteinase-3 in patients with AML and underline the potential of these antigens for vaccine approaches in leukemia. In addition no signs for WT1 or Proteinase-3 mediated autoimmunity were observed neither in leukemic patients nor in healthy controls. Following these data we conducted based on the successful vaccine schedule in melanoma a WT1 peptide vaccination trial with GM-CSF and KLH as adjuvants in patients with AML and MDS. When starting the vaccine trial, it was uncertain, if a vaccination with a single epitope could be of immunological efficacy in patients with acute leukemia after chemotherapy. Surprisingly we observed immunological efficacy in the same range as observed in untreated melanoma patients and in addition remarkable clinical activity, warranting further investigations. By now our results were confirmed by other groups and firm the basis of a commercial vaccine trial with a truncated WT1 Protein currently performed in leukemic patients. Of essential importance for further development of vaccine strategies will be in addition to detailed immunological, molecular and clinical analyses the identification of immune resistance mechanism of tumor cells under the pressure of vaccine induced immune response. In this context our group could demonstrate in one analysis, not included in this work, that defects in antigen presentation caused by loss or mutation of WT1 or downregulation of HLA molecules are not the major basis for escape from the immune response induced by WT1 peptide vaccination In another analysis we evaluated the clonal composition of vaccine induced T cells in a patient with recurrent AML vaccinated in the WT1 peptide vaccination study, who achieved a complete remission lasting for 12 months. In conclusion, we could for the first time demonstrate the evolution and compartmentalization of a peptide vaccine-induced T-cell clone in peripheral blood and bone marrow of an AML patient. At the time of relapse, the same clone reappeared spontaneously in peripheral blood but not in bone marrow showing impaired functionality. In summary this work provides important immunological basic information of spontaneous and of vaccine induced T cell immunity in patients with melanoma and leukemia. In particular we identified the bone marrow as an important immunological compartment, harbouring high frequencies of memory T cells, which might be a valuable source for generating specific memory T cells for vaccination and adoptive transfer. The demonstration of immunological and clinical efficacy of peptide vaccinations in combination with GM-CSF and KLH in melanoma patients as well as in leukemic patients is an important fundament for effective advancement of vaccine strategies in the future. In this context the more detailed and consequent identification of clinical relevant mechanism of resistance will be of crucial importance.