Peptidische Inhibitoren einer Filarienchitinase: Selektion und Charakterisierung

Abstract

Chitinasen sind weitverbreitete Enzyme, welche die Hydrolyse von N -Acetylglucosamin-Homopolymeren katalysieren. Sie stellen potentielle Zielmoleküle für Inhibitoren mit chemotherapeutischer Wirkung z. B. gegen Bakterien, Pilze oder Parasiten dar. Bekannte Chitinaseinhibitoren bedienen sich überwiegend eines nicht enzymspezifischen, kompetitiven Wirkmechanismus durch Nachahmung von Substraten oder Reaktionsintermediaten. In der vorliegenden Arbeit sollten peptidische Hemmstoffe für Chitinase aus der Nagerfilarie Acanthocheilonema viteae mittels Phagendisplay selektiert und anschließend charakterisiert werden. A. viteae gilt als Modellorganismus für Onchocerca volvulus, den Erreger der Flussblindheit, einer weitverbreiteten Infektionserkrankung durch humanpathogene Fadenwürmer. Vorhandene Therapien gegen Filariosen zeigen verschiedene, mitunter schwere Nebenwirkungen und sind überwiegend unwirksam gegen adulte Fadenwürmer. Chitinasen sind bedeutsam im Rahmen der Entwicklung und Transmission der Parasiten, die Entwicklung von spezifischen Hemmstoffen dient somit der Etablierung neuer Therapiekonzepte. Chitinase aus A. viteae wurde rekombinant in Eschericheria coli exprimiert, gereinigt und kinetisch charakterisiert. Unter Nutzung zweier Phagendisplay- Peptidbibliotheken konnten lineare bzw. disulfidzyklisierte Peptide aufgefunden werden, welche A. viteae-Chitinase mit Ki-Werten im unteren mikromolaren Bereich kompetitiv hemmten. Die Peptide erwiesen sich als spezifisch für Chitinase aus A. viteae und eng verwandten Filarien. Unter Nutzung von Substitutionsanalysen, zunächst im Rahmen eines Alanin-walks, anschließend mit Hilfe zellulosebasierter Substitutionsbibliotheken, konnten für die Hemmung wichtige Aminosäuren in der Peptidsequenz identifiziert und Hinweise zur Interaktion zwischen Peptiden und Enzym gewonnen werden. Die aufgefundenen Inhibitoren binden vermutlich über hydrophobe und ionische Wechselwirkungen an überwiegend konservierte Aminosäurereste der Chitinase. Mittels Strukturmodellierungen und Sequenzanalysen konnten die Ergebnisse der Substitutionsanalysen untermauert und mögliche Mechanismen der beobachteten Spezifität diskutiert werden. Weitere Untersuchungen zur Wirkung der Peptide auf Filarien sowie zur strukturellen Grundlage der gefundenen Chitinasehemmung sind als sinnvoll anzusehen.

Background: Chitinases are widespread enzymes which catalyze the hydrolysis of N-acetyl-glucosamine homopolymers. They are attractive targets for inhibitors with chemotherapeutic potential against bacteria, fungi or parasites. Most known inhibitors act competitively by mimicking substrates or reaction intermediates, usually in a non-specific manner. In this thesis, peptide inhibitors of chitinase from the rodent filaria Acanthocheilonema viteae should be selected and analyzed. A. viteae can be used as a model for Onchocerca volvulus, the cause of river blindness, a widespread infection disease. Actual strategies to eliminate this disease have numerous side effects and are mostly ineffective against adult filariae. Chitinases are important molecules for the development and transmission of parasitic nematodes and thought to be promising targets for new therapeutical approaches. The design of specific chitinase inhibitors could therefore be a further step in drug development against filariasis. Method: Chitinase from A. viteae was overexpressed in Eschericheria coli, followed by purification and kinetic analysis. Two different M13 phage-display libraries were screened. DNA of selected phages was extracted and sequenced. Peptides were synthesized and tested for inhibition of the hydrolytic activity of A. viteae chitinase. Results: One linear and one constrained peptide which bound to A. viteae chitinase competitively inhibited enzyme function with Ki values in the low micromolar range. These peptides showed specific inhibitory behaviour against chitinase from A. viteae and closely related filariae. By the help of substitutional analyses using chemical synthesized peptides, characteristic amino acids with importance for the inhibition could be identified. Based on modelling and docking analyses as well as sequence comparisons putative mechanisms of the observed specific inhibition could be disclosed. Conclusions: Phage-display based selection for ligands was found to be an appropriate method to find specific inhibitors of chitinases. Substitutional analyses are useful to identify inhibition-relevant amino acids within the peptide sequence. Found inhibitors are probably making hydrophobic as well as ionic interactions with predominantly conserved residues of the chitinase. The peptides or derived peptidomimetic molecules should be studied for effects on filarial nematodes in vivo. Structural enlightment of an enzyme-inhibitor complex could give further information about the mode of operation of filarial chitinases.