Untersuchungen zu bioabbaubaren Genvektoren und in situ gebildeten Filmen als neue Arzneiformen für die Applikation von Gentherapeutika

Abstract

Die Gentherapie birgt vielversprechendes Potential als Kausaltherapie für die Behandlung zahlreicher vererbter und erworbener Krankheiten. Nukleinsäuren als neue Arzneistoffe sind sehr vielfältig einsetzbar, setzten allerdings einen erfolgreichen Transport zum Wirkort voraus. Lange Zeit dominierten virale Systeme klinische Studien auf dem Gebiet der Gentherapie, da diese zu hohen Genexpressionsraten führten. Schwerwiegende Nebenwirkungen bewirkten allerdings einen leichten Rückgang zugunsten nicht-viraler Systeme in den letzten Jahren. Die größte Herausforderung für eine erfolgreiche therapeutische Anwendung bleibt daher der effiziente Transfer an den Zielort bei gleichzeitig guter Verträglichkeit und kontrollierten Expressionsraten. Gegenstand des ersten Teils dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuartigen polymeren Trägersystems für den nicht-viralen Gentransfer mit dem Fokus auf die Lunge. Untersucht wurden bioabbaubare chimäre Polymer-Polypeptid Konjugate auf Methacrylat-Basis im Vergleich zu herkömmlichen Trägersystemen wie dem verzweigten Polyethylenimin (brPEI) 25kDa. Oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylat (OEGMA) verschiedener Kettenlängen and N,N-dimethylaminoethyl methacrylat (DMAEMA) wurden mittels ATPR zu definierten P(DMAEMA-co-OEGMA) Copolymeren mit konstantem Polymerisierungsgrad, aber unterschiedlichem PEGylierungsgrad (OEGMA-Anteil und Oligomerisierungsgrad des OEGMA-Monomers) polymerisiert. Die biophysikalische Charakterisierung der Polyplexe ergab, dass Partikelgröße, Bindungsstärke, Morphologie und Zetapotential der Partikel durch den PEGylierungsgrad variiert werden konnte, so dass eine maßgeschneiderte Anpassung des Trägersystems an den eingesetzten Nukleinsäuretyp und an die gewünschten Partikelcharakteristika ermöglicht wurde. Eine ausreichende sterische Stabilität der Polyplexe bei hoher Plasmid- DNA Konzentration in isotonischer Kochsalzlösung und eine geringe Zytotoxizität der Polyplexe konnte bereits durch geringen PEGylierunsgrad erzielt werden. Die Einführung ungeladener hydrophiler OEG-Segmente führte zur Abschirmung der positiven Oberflächenladung unabhängig von der verwendeten Nukleinsäure. Zetapotentialmessungen deuteten auf eine "Core-Shell- Corona''-ähnliche Partikelstruktur hin, die im Wässrigen durch eine hydrophile PEG Schale stabilisiert wurde. Transfektionsstudien mit Plasmid-DNA zeigten eine Reduktion des Gentransfers durch Einführung von OEG-Einheiten auf Lungenzelllinien, wobei die Transfektionseffizienz optimierter P(DMAEMA-co- OEGMA) Copolymere vergleichbare Werte zu P(DMAEMA) und um den Faktor 10 geringer als brPEI lieferten. Gründe hierfür waren i) eine ungenügenden Komplexierung, ii) eine moderate Zellbindung sowie iii) eine unzureichende endosomale Freisetzung. Überraschenderweise zeigte sich augrund verbesserte Komplexierung zu nanoskaligen Polyplexen eine Steigerung der Gentransfereffizienz von mRNA mit P(DMAEMA-co-OEGMA) Copolymeren im Vergleich zu P(DMAEMA). Ferner wurde durch Veränderungen im Polymerdesign eine 6-fache Erhöhung der Gentransfereffizienz in vitro bewirkt. Kombiniert mit funktionellen Peptide, wie dem endosomolytisch aktiven INF7-Peptid oder dem zellpenetrierenden TAT-Dimer, war eine Steigerung bis um den Faktor 100 möglich. Unter Einsatz von Copolymeren mit optimierten PEGylierungsgrad konnte nach intratrachealer Applikation eine 7-fach gesteigerte Genexpression im Vergleich zu br-PEI 25kDa in der Lunge gemessen werden. Nicht zuletzt aufgrund der guten kolloidalen Stabilität und der guten Biokompatibilität stellen P (DMAEMA-co-OEGMA) Copolymere daher eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Trägersystemen im nicht-viralen Gentransfer dar. Erfolgversprechend erscheinen auch die Ansätze in Kombination mit mRNA, die im Gegensatz zur pDNA bereits im Zytoplasma wirksam ist und für die bis heute keine effektiven Transfersysteme bekannt sind. Im weiteren Teil der Arbeit wurde ein Film zur kontrollierten Freisetzung nicht-viraler Genvektoren entwickelt. In situ geformte Implantate wurden bereits als Alternative zu ex vivo hergestellten Matrices für Proteine untersucht. Im Bereich des Gentransfers ist allerdings wenig bekannt. Für Herstellung der Filme wurde ein Applikationssystem der Firma Baxter eingesetzt, das aus einer 10%igen (m/v) PLGA-Lösung in einem biokompatiblen, wassermischbaren Lösungsmittel gelöst (lipophilen Komponente) und Wasser für Injektionszwecke (hydrophilen Komponente) bestand. Die mechanische Festigkeit der Filme und der Einbau der Polymere in die Matrix wurden durch die Wahl des Lösungsmittels und des Polymers bestimmt, so dass besonders hochmolekulare Polymere mit veresterten Endgruppen in Kombination mit einer guten Wassermischbarkeit des verwendeten Lösungsmittels zu einer guten Filmbildung führten. Als Matrixbildner wurden PLGA Polymere unterschiedlicher Kettenlänge und Zusammensetzung getestet, um die die Freisetzungskinetik der Polyplexe zu kontrollieren. Lyophilisierte pDNA/l-PEI Polyplexe als Modellwirkstoff konnten erfolgreich in den gebildeten Film eingebaut werden, indem die Polyplexe zuvor in der hydrophilen Phase gelöst oder in der lipophilen Phase dispergiert wurden. Freisetzungsstudien zeigten, dass der Einbau der Polyplexe in die Filme und deren Freisetzungskinetik durch die Wahl des Lösungsmittels, des Molekulargewichts des Polymers sowie der Einbettungsvariante gesteuert werden konnten. In situ geformte Filme sind in der Lage, lyophilisierte Polyplexe über einen Zeitraum von 4 Wochen freizusetzen, und können darüber hinaus als physikalische Barriere fungieren. Daher schienen diese Filme zur Verhinderung peritonealer Verwachsungen nach Operationen im Bauchraum geeignet, bei denen es innerhalb 2-3 Wochen nach dem Eingriff zur Bildung fibröse Strukturen kommt. Diese sind vor allem ein krankhaftes Ungleichgewicht zwischen dem gewebespezifischen Plasminogenaktivator (tPA) und dessen Inhibitior (PAI-1) zurückzuführen. Der Einbau einer für tPA kodierenden Plasmid-DNA (ptPA) in den Sprühfilm führte zu einem tPA-Spiegel von 2 ng/ml über einen Zeitraum von 16 Tagen in vitro. Ferner konnte durch Kotransfektion der Plasmid-DNA mit einer siRNA gegen PAI-1 ohne Einbau in den Film eine 8,3 fache Steigerung des tPA/PAI-Verhältnisses 48 h nach der Transfektion erzielt werden. Diese Steigerung korreliert gut mit dem Abfall des Verhältnisses im entzündeten Gewebe. Die Kombination beider Ansätze und deren therapeutische Relevanz hängen von den weiteren in vitro und in vivo Ergebnissen ab und bleiben daher abzuwarten. Nichtsdestotrotz stellen in situ geformte Filme, aufgebaut aus bioabbaubaren und gewebeverträglichen Polymeren, eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Trägersystemen für den Gentransfer dar, um kurze Expressionszeiten und Nebenwirkungen aufgrund zu hoher Nukleinsäurespiegel zu verhindern.

Gene therapy is currently under development and investigation for the treatment of various inherited and acquired diseases. Therefore, nucleic acids as novel class of compounds are of high interest. However, they have to be delivered intracellular to reach their target cellular compartment. Viral systems have dominated the field of clinical trials in gene therapy due to their high efficiency Serious side effects led to the emerging field of non- viral gene therapy where a wide range of delivery systems have been investigated in the past few years. However, none of them entirely fulfilled the requirements of successful gene therapy such as high transfection efficiency, good biocompatibility and transient and controlled expression levels. The overall aim of the first part of this thesis was the evaluation of novel polymeric based delivery systems for non-viral gene transfer, particularly into lung cells. Biodegradable chimeric polymer-polypeptide conjugates based on methacrylate were investigated in comparison to standard carriers such as branched polyethylenimine (brPEI) 25 kDa. Oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylates (OEGMA) of various chain-lengths and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate (DMAEMA) have been copolymerized by atom transfer radical polymerization yielding well-defined P(DMAEMA-co-OEGMA) copolymers with increasing PEGylation (OEGMA molar fractions and different chain-lengths) but comparable degrees of polymerization. Biophysical characterization of polyplexes revealed that the degree of PEGylation strongly influenced particle size, morphology and zeta potential; thereby allowing to form tailor-made gene vector complexes for different types of nucleic acids and particle characteristics of interest. P(DMAEMA-co-OEGMA) copolymers formed gene vectors with excellent colloidal stability at high plasmid DNA concentrations in isotonic saline and low cytotoxicity even at a low degree of PEGylation. The shielding effect of the PEG side-chains was obvious for both plasmid DNA and mRNA complexes as evidenced by a reduction of the surface charge. Zetapotential measurements further revealed that these copolymers lead to the formation of a core-shell-corona like particle structure, which is stabilized in aqueous media by a hydrophilic PEG shell. Transfection efficiency on lung cell lines using pDNA was found to be reduced by introduction of OEG-Segments, while the transfection efficiency of optimized P (DMAEMA-co-OEGMA) copolymers were found to be comparable with P(DMAEMA) and 10-fold lower compared to br-PEI 25 kDa. Higher degrees of PEGylation seems to limit transfection efficiency of these gene vectors due to i) a loss of compact gene vector shape, ii) moderate cellular binding efficiency and iii) reduced endolysosomal escape. Surprisingly, PEGylation of P(DMAEMA) increased mRNA transfection, most likely due to better stability of nanosized polyplexes. Besides, changes in polymer design increased the buffering capacity and resulted in a 6-fold increase in transfection efficiency. Codelivery with the peptides INF 7, an endosomolytic peptide, and TAT-Dimer, a cell penetrating peptide with NHL? nuclear localisation signal function, further increased gene transfer efficiency of DMAEMA-co-OEGMA) copolymers up to 100-fold. Optimized P(DMAEMA-co-OEGMA) gene vectors remained stable under conditions for in vivo application leading to 7-fold greater gene expression in the lung compared to br-PEI. Therefore, tailor-made P(DMAEMA-co-OEGMA) copolymers are promising non-viral gene transfer agents which fulfil the requirements for successful in vivo gene delivery. Cationic polymers have been intensively investigated for plasmid DNA delivery, but only a few studies address their use for mRNA transfection. Hence, these copolymers may help to further improve mRNA delivery using cationic polymers to better understand their potential for future applications. The second part of the thesis was focused on developing an in situ forming film for sustained release of nucleic acids. In situ forming implants have been previously proposed as an alternative to ex vivo matrix formation for protein delivery. However less is known for gene delivery. An application system from Baxter was applied to form sprayable films comprised of a water-insoluble biodegradable polymer dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent (lipophilic part) and water for injections (hydrophilic part). Mechanical strength and matrix quality, i.e. encapsulation amount of polymer into the matrix, strongly correlated with the solvent and the chain-length of the PLGA polymer used. In this context, good water-miscible solvents and polymers with high chain-length and estered end groups revealed good film characteristics. PLGA polymers of different chain- length and compositions were evaluated as polymer matrix composites to control release kinetics. Lyophilized pDNA/l-PEI polyplexes were successfully encapsulated within the polymer matrix as it solidifies if the particles were either dissolved in the hydrophilic phase or dispersed in the lipophilic phase of the spray device. Dissolution studies revealed that encapsulation efficiency and release kinetics of polyplexes can be controlled by the solvent, the polymer chain length and the encapsulation techniques used. Sprayable in situ forming films can provide prolonged gene expression over a 1-month release time periode. Hence, these physical barriers systems might be useful to overcome the shortcomings of treating peritoneal adhesions, where two weeks after abdominal surgery fibrous bands of scar tissue are formed as a result of a disordered ratio between tissue plasminogen activator (tPA) and the plasminogen activator inhibitor (PAI-1). Encapsulation of plasmid DNA, encoding for tPA (ptPA), into the sprayable film matrix revealed a 4-fold increase compared to the empty control over 2-weeks in vitro. Besides, co- delivery of ptPA and siRNA against PAI-1 without matrix encapsulation further led to 8.3-fold increase of tPA/PAI-1 ratio in cell culture after 48 h, which is in line with the reduction observed in diseased tissue. Applicability of the delivery systems by incorporating both siRNA and pDNA has to be further demonstrated in vitro and in vivo. Nevertheless, in situ forming controlled release systems using biocompatible and biodegradable polymers provide an attractive alternative approach for gene transfer to overcome short-term gene expression and safety problems related to high concentrations of nucleic acid or gene carriers not only for the treatment of adhesive diseases.