Suche, Reinigung und Identifizierung eines Urotensin II metabolisierenden Enzyms

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war, ein Urotensin II (UII) metabolisierendes Enzym (UME) aus dem Gewebe von Schweinenieren aufzuspüren, zu reinigen und zu identifizieren. Das Massenspektrometrie-basierte Enzym Screening System (MES- System) wurde zum Nachweis der UME-Aktivität genutzt. Die optimalen chromatographischen Parameter zur Reinigung des UME wurden mittels PPS-Systems bestimmt. Unter Anwendung der beiden Systeme MES und PPS wurde nach vier chromatographischen Reinigungsschritten eine nahezu homogene Fraktion mit UME- Aktivität aus Nierengewebe gewonnen. In dieser Fraktion konnten mittels LC-ESI MS/MS Analyse die Proteasen Faktor IXa und Xaa-Pro Aminopeptidase 1 identifiziert werden. Zur Validierung dieses Ergebnisses und zur Beantwortung der Frage, ob der F IXa auch im Menschen eine UII-metabolisierende Funktion hat, wurde humaner Faktor IXa kommerziell erworben und mit positivem Ergebnis auf UII metabolisiende Aktivität überprüft. Damit ist es gelungen erste Hinweise zu sammeln, dass der Faktor IXa im menschlichen Organismushumane an der Inaktivität des UII beteiligt ist. Dieser Zusammenhang könnte auch auf eine Rolle des UII im Hämostasesystem deuten.

The objective of this work was to detect, purify and identify an UII metabolizing enzyme (UME) in the porcine renal tissue extract. For detecting the UME activity a mass spectrometry-based screening enzyme system (MES- system) was developed. The optimum chromatographic parameters to purify the UME were determined with the PPS system. After four chromatographic purification steps a nearly homogenous fraction with UME activity was purified from renal tissue. In this fraction the proteases factor IXa and Xaa-Pro 1 aminopeptidase were identified by LC-ESI MS / MS analysis. For validating these findings and answering the question, if factor IXa metabolizes UII in humans also, human factor IXa was purchased and tested for its UME activity with a positive result. Therefore in this study first data were collected showing that factor IXa is involved in the inactivation of UII pointing to a potential role of UII in the haemostatic system.