dc.contributor.author
Goerres, Ute
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:08:53Z
dc.date.available
2001-12-20T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10101
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14299
dc.description
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Lebenslauf
1\. Einleitung
2\. Material
3\. Methoden
4\. Ergebnisse
5\. Diskussion
6\. Zusammenfassung/Summary
7\. Literaturverzeichnis
8\. Anhang
dc.description.abstract
Die Immuntherapie wird zukünftig im Rahmen der Behandlung von
Tumorerkrankungen
einen immer größeren Stellenwert einnehmen. Es besteht die dringende
Notwendigkeit,
die konventionelle, mit starken Nebenwirkungen behaftete Chemotherapie durch
neue
Therapiekonzepte zu ergänzen. Die Immuntherapie nutzt humorale sowie zelluläre
Komponenten der Immunabwehr und zeichnet sich durch eine hohe,
tumorspezifische
Wirkung bei sehr guter Verträglichkeit aus. Intensive Forschungsarbeiten
werden auf
den Gebieten der Antikörpertherapie sowie der Tumorvakzinierung durchgeführt.
Ergebnisse dieser Bemühungen sind die Zulassungen der ersten beiden Antikörper
für den
Einsatz in der Krebstherapie. Diese Antikörper finden in der Behandlung von
Lymphomen
sowie Brustkrebs Anwendung und werden zumeist in Verbindung mit einer
Chemotherapie
eingesetzt.
Alle immuntherapeutischen Behandlungsstrategien beinhalten als notwendige
Voraussetzung
die Identifizierung tumorassoziierter Oberflächenantigene. Diese dienen als
Ziel für
Antikörper oder werden zur Stimulierung des patienteneigenen Immunsystems
verwendet.
Bisher stehen nur wenige, überdies recht aufwendige Techniken zur Definition
tumor-
spezifischer Antigene zur Verfügung (Detektion mit T-Zellen, SEREX). Im Rahmen
der
vorliegenden Arbeit sollten zwei Methoden zur Bestimmung tumorspezifischer
Antigene
entwickelt werden, die auf dem Screening von Lambda-Phagen-cDNA-
Expressionsbanken beruhen.
Zunächst wurde ein modifiziertes SEREX-System zur Detektion membranständiger
Antigene
etabliert. Aus der RNA zweier Mammakarzinomzellinien wurde eine cDNA-
Expressionsbank in dem
Lambda-Phagen-Expressionsvektor ZAP® II erstellt. Eine Balb/c-Maus wurde mit
Membranfraktionen
der gleichen Zellinien immunisiert und der Anstieg des Mammakarzinom-
spezifischen IgG-Spiegels
im Serum mittels Zellmembran-ELISA dokumentiert. Insgesamt 480.000 Klone der
cDNA-Bibliothek
wurden mit Mausserum der sechsten Woche nach Immunisierung gescreent. Es
wurden ein deutlich
sowie ein schwach positiver Plaque detektiert, vereinzelt und die Inserts
sequenziert. Das
Insert des deutlich positiven Klons befand sich im Einklang mit dem
Vektorleseraster und
kodierte für humanes Mitofilin, ein membranständiges Mitochondrien-Protein
ohne Bezug zum
Tumorgeschehen. Da die für die Immunisierung verwendeten Membranfraktionen
auch zytoplasmatische
Membranen enthielten und Mitofilin eine hohe Immunogenität besitzt, wurde
offensichtlich ein
hoher Antikörpertiter gegen dieses Protein induziert, der jedoch
höchstwahrscheinlich nicht
tumorspezifisch war.
Der schwach positive Klon kodierte für humanes Rheb (Ras Homologue Enriched in
Brain), zeigte
jedoch keine Übereinstimmung mit dem Vektorleserahmen. Daher kam es zur
Bildung eines Nonsens-
Proteins, welches von Serumantikörpern als fremd erkannt und somit detek-tiert
wurde. Es lag
hiermit keine spezifische Reaktion gegen das Rheb-Protein vor. Da es sich um
ein Ras-Homolog
handelt, welches zudem onkogene Mutationen aufweist, erhob sich die Frage, ob
dieses Gen, obwohl
keine Antikörperreaktion vorlag, an der Entstehung von Mammakarzinomen
beteiligt ist. Diese
Vermutung lag nahe, da eine Überexpression von normalem Ras in
Brustkrebstumoren ein invasives
Wachstum bedingt. Die Quantifizierung des Rheb-Gens in sechs verschiedenen
Mammakarzinomen im
Vergleich zu normalem Brustgewebe ergab eine Verminderung der Expression in
allen untersuchten
Tumorgeweben. Diese Unterexpression zeigte sich besonders eindeutig in zwei
Tumoren mit einer
Reduktion um 74% bzw. um 82,4%. Aufgrund dieser Ergebnisse und der Tatsache,
daß andere Autoren
für Rheb bereits eine Ras-antagonistische Wirkung nachgewiesen haben, kann
vermutet werden, daß
es sich um ein Tumor-Suppressor-Gen handelt. Durch die Krev-ähnliche Blockade
des Ras-Signaltrans-
duktionsweg kommt es wahrscheinlich zu einer Transformations-inhibierenden
Wirkung sowie zu einem
verlangsamten Tumorwachstum.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine weitere Methode zur Definition
tumorspezifischer Antigene
entwickelt, welche auf der Detektion des Zielantigens von auf Tumorzellen
selektionierten, anti-
körpertragenden filamentösen Phagen in einer lambda-Phagen-cDNA-
Expressionsbank basiert. Als
Modellsystem diente das hauptsächlich auf Lymphomen exprimierte CD30-Antigen
sowie der anti-CD30
Antikörper Ki-4 und das abgeleitete, auf Phagen exprimierte Antikörperfragment
(scFv). Es konnte
demonstriert werden, daß sowohl in einer 1:1- als auch einer 1:200 Mischung
von CD30-positiven und
irrelevanten Lambda-Phagen-Klonen mit 2,5 x 1012 sowie 5 x 1012 Ki-4-scFv
filamentösen Phagen pro
Filter positive Signale generiert wurden. Die CD30-spezifische Bindung konnte
durch eine Kompetition
mit dem Ki-4 moAk belegt werden. Darüber hinaus wurden die Inserts einiger
positiver Klone sequenziert.
Alle enthielten das CD30-Antigen. Die unspezifische Färbung der Blots durch
die filamentösen Phagen
war bei der Verwendung von 50 µl (2,5 x 1012 pfu) bzw. 100 µl (5 x 1012 pfu)
dieser Phagen am größten.
Waren nur wenig positive Plaques vorhanden (1:200-Mischung), so kam es zu
einer intensiveren Hinter-
grundbildung. Es zeigte sich auch, daß, verglichen mit der Positivkontrolle
des Ki-4 monoklonalen
Antikörpers, in der 1:200 Mischung vermutlich nicht alle CD30-positiven
Plaques erkannt wurden. Dies
ist wahrscheinlich auf die stark erhöhte Hintergrundfärbung zurückzuführen,
die eine Differenzierung
zwischen positiven und Hintergrundplaques erschwert. Um eine Reduzierung der
nicht spezifisch bindenden
filamentösen Phagen zu erzielen, werden künftig weitere Untersuchungen
durchgeführt. Mit den hier präsen-
tierten Arbeiten konnte erstmalig gezeigt werden, daß ein auf filamentösen
Phagen exprimiertes Antikörper-
fragment sein zugehöriges Antigen in Tausenden irrelevanter Lambda-Phagen-
Plaques erkennt. Durch die
Kombination des Screenings von Lambda-Phagen-cDNA-Expressionsbanken mit dem
phage display System wurde
eine neue Methode zur Detektion tumorspezifischer Antigene etabliert und deren
Funktionalität im Modell-
system nachgewiesen.
de
dc.description.abstract
As conventional chemotherapy is associated with severe side effects there is
the need to develop
new strategies for the treatment of cancer. One possibility to supplement
conventional therapy is
to use the advantages of immunotherapy. Immunotherapy stimulates both humoral
and cellular components
of the immune system and shows high tumor specifity without causing serious
side effects. A lot of
investigations have been carried out to develop anti cancer antibodies as well
as tumor vaccines.
Two monoclonal antibodies have been approved by the FDA so far.
A prerequisite for the successful application of immunotherapeutics is the
discovery of tumor specific
antigens which serve as targets for monoclonal antibodies. In the field of
cancer vaccination antigens
are employed for stimulation of the patients´ immune system. Up to now only a
few possibilities exist
for the detection of tumor specific antigens. These methods implicate complex
and time consuming
procedures which are difficult to establish (SEREX, T-cell based systems).
The purpose of this work was to develop new strategies for the detection of
tumor specific antigens
based upon the screening of lambda-phage cDNA expression libraries.
First a modified SEREX system was established in order to identify membrane-
associated proteins.
RNA was isolated from two mammary carcinoma cell lines and a cDNA library was
prepared using lambda-
phage-vector ZAP® II. A Balb/c mouse was immunized with membrane fractions
from the same cell lines.
A significant increase in specific antibody serum levels was demonstrated by
cell membrane ELISA.
Screening of 480.000 plaques with serum from mice 6 weeks p.i. yielded one
strongly positive and one
weakly positive clone. The nucleotide sequence of the strongly positive clone
was in register with the
junctional l phage vector sequence and coded for human Mitofilin, a
transmembrane protein of the inner
mitochondrial membrane. Recombinant Mitofilin protein was found to be highly
immunogenic which might be
the reason for a high anti-Mitofilin antibody titer in mice immunized with
membrane fractions. As
Mitofilin is an ubiquitous protein and the amino acid sequence contained no
changes that alter protein
structure, the immune response cant´t be considered to be tumor specific.
The second clone which seemed to be weakly positve coded für human Rheb (Ras
Homologue Enriched in Brain).
As the insert sequence was not in frame with the vector it can be supposed
that a nonsense protein is
produced which is detected by serum antibodies. Nevertheless reaction against
this protein is not specific.
As Rheb represents a ras homolog with oncogene mutations it could be of
interest if this protein is involved
in the development of breast cancer. Quantification of the Rheb gene in six
mammary carcinomas in comparison
to normal breast showed that Rheb gene expression was decreased in the
carcinomas. Suppression was striking
in two tumors with 74% and 82,4% reduction compared with normal breast tissue.
As it has already been proven
that Rheb antagonizes ras transforming effects it could be speculated that
Rheb could serve as a tumor
suppressor gene in breast cancer development. Rheb might block the ras signal
transduction pathway and
inhibit transformation and tumor growth.
The second part of the work included the development of a new strategy to
define the target antigen of a
peviously selected scFv in a lambda phage cDNA expression library. To provide
the prove of principle an artificial
model system was established employing the anti-CD30 scFv Ki-4 generated by
phage display technology to detect
immobilized recombinant human CD30 receptor mixed in an irrelevant cDNA
library. Investigations were carried out
to determine the titre of antibody displaying phage providing optimal antigen
detection and minimal background
staining for different ratios of CD30 receptor- and irrelevant lambda phage.
It could be demonstrated that a minimum of 2,5 x 1012 scFv expressing phage
per blot is required to generate
positive signals both in a 1:1 and a 1:200 mix of CD30 positve and irrelevant
lambda phage. Specifity of Ki-4-scFv
phage binding was verified by competition experiments with Ki-4 monoclonal
antibody. In addition inserts of four
CD30 positive lambda phages were sequenced. All clones contained the CD30
antigen insert. Background reaction was
increased at 5 x 1012 pfu/filter and 2,5 x 1012 pfu/filter but positive
signals were still clearly distinguishable
from nonreactive clones in the 1:1 mix. Binding Ki-4 scFv phage showed a
weaker color reaction compared to Ki-4 moab.
In the 1:200 mix the number of positive clones was decreased when compared
with staining by Ki-4 monoclonal antibody.
This might be due to higher background reaction caused by unspecific binding
filamentous phage which makes it difficult
to distinguish between positive and background plaques. In order to reduce non
specific binding further experiments
will be carried out to optimize the system presented in this work.
It was shown for the first time that a scFv expressed on filamentous phage
detects its target antigen in thousands of
irrelevant lambda phage cDNA clones. The method described in this study
provides a powerful tool to detect new tumor
specific target antigens and their respective antibodies by combining phage
display technology with screening of lambda
phage cDNA libraries.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Immunologisches Screening von Lambda-Phagen-cDNA-Expressionsbanken zur
Detektion neuer tumorassoziierter Antigene
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. M F. G. Schmidt
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. A. Engert
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. E. Reinwald
dc.date.accepted
2001-01-18
dc.date.embargoEnd
2002-01-17
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2000001606
dc.title.translated
Immunoscreening of lambda phage cDNA expression libraries for the detection of
tumor associated antigens
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000339
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2000/160/
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FUDISS_derivate_000000000339
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