Strukturelle Basis für die Bindung des Omega-Repressors an direkte und invertierte Wiederholungen von DNA-Heptaden

Abstract

Der vom Streptococcus pyogenes Plasmid pSM19035 kodierte Omega-Repressor reguliert die Expression von Genen, deren Genprodukte an der Kontrolle der Kopienzahl und der dauerhaften Erhaltung des Plasmids im Wirt beteiligt sind. Der Omega-Repressor gehört zur Familie der MetJ/Arc-Überfamilie DNA-bindender Proteine mit RHH-Motiv, die mit einem antiparallelen, zweisträngigen beta- Faltblatt in die große Furche der DNA binden. Die strukturell bekannten RHH- Proteine binden alle an palindromische Operatoren. Demgegenüber bindet der Omega-Repressor kooperativ an 4 bis 10 Kopien aufeinander folgender Heptaden (5 -A/T ATCAC A/T-3 , symbolisiert durch ->), welche palindromisch in (-><-) und (<\-->) Anordnungen vorliegen können, aber auch direkt und damit nicht- palindromisch als (->->) wiederholt werden können. In dieser Arbeit konnten die Strukturen des N-terminal verkürzten Omega-Repressors ∆19Omega aufgeklärt werden, der als Dimer (∆19Omega2) an zwei minimale Operatoren mit zwei Heptaden in einer palindromischen (-><-) und in einer nicht-palindromischen Anordnung (->->) gebunden ist. Die ∆19Omega Dimere binden asymmetrisch an die Heptaden, und Interaktionen zwischen den Helizes α1 benachbarter ∆19Omega- Dimere sorgen für die kooperative Bindung. Die pseudo-C2M-Rotationsachsen, welche die beiden Untereinheiten der Dimere ineinander überführen, schneiden die lokalen DNA-Helixachsen aussermittig ~0,3 Å stromabwärts der zentralen GC- Basenpaare der Heptaden (5 -A/T ATCAC A/T-3 ). Dies hat zur Folge, dass die zwei an (->->) gebundenen Dimere einen Abstand von exakt 7-bp zueinander einhalten, an (-><-) gebunden verkürzt sich dieser Abstand jedoch um 0,6 Å. Trotzdem wird in beiden Strukturen ein identischer Dimer-Dimer Kontakt beobachtet, und der verkürzte Dimer-Dimer-Abstand wird durch eine Konformationsänderung der alpha1-Helix gegenüber der Kernstruktur des zugehörigen Dimers kompensiert. Aufgrund dieser beiden Strukturen kann für die Bindung des Omega-Repressors an Operatoren mit einer (<\-->)-Anordnung vorhergesagt werden, dass die Dimere 0,6 Å weiter voneinander entfernt an die Heptaden binden als dies für die Bindung an (->->) der Fall ist. Möglicherweise ähnelt der Dimer-Dimer Kontakt dieses Komplexes den in dieser Arbeit beobachteten, jedoch müssen sich die Helizes alpha1 weiter von der Kerndomänen der Dimere entfernen, was wahrscheinlich energetisch ungünstig ist. So ist die sechsfach schlechtere Bindung von Omega2 an (<\-->) gegenüber (->->) und (-><-) zu erklären. Die vom Omega-Repressor reprimierten Promotoren der Plasmide der inc18 Familie nutzen diese Unterschiede in der Bindungsaffinität von Omega2 für verschiedene Anordnungen der Heptaden als Instrument für die Modulation der Promotoraktivität. Neben den ∆19Omega-DNA- Komplexen wurde in den asymmetrischen Einheiten der Kristallstrukturen auch freie (unbesetzte) Operator-DNA beobachtet. Dadurch konnte detailliert beschrieben werden, welche Konformationsänderungen die Operator-DNA bei der Bindung des Repressors eingeht. Interessanterweise nimmt die freie DNA bereits eine charakteristische Konformation ein, welche bei der Repressor-Bindung nur geringfügig verändert wird. Biochemischen Studien zufolge bindet der N-Terminus des Omega-Repressors an das ParA homologe Delta-Protein und stimuliert dessen ATPase Aktivität. Damit könnte der Omega-Repressor die Bindung des Delta-Proteins an die Plasmide vermitteln und so die Rolle des bisher unbekannten ParB-Partners in bekannten ParA/ParB-Systemen zur Plasmid- Verteilung übernehmen. Weitere Studien zur aktiven Plasmid-Verteilung während der Zellteilung werden zur Zeit in Zusammenarbeit mit Aslan Cicek unternommen. Insbesondere sollen mittels Cryo-elektronenmikroskopischer Studien Aufschluss über die Struktur und Zusammensetzung des Nucleoprotein-Komplexe bestehend aus Omega- Repressor, Delta-Protein und Operator-DNA liefern.

Homodimeric ribbon-helix-helix (RHH2) proteins of the MetJ/Arc superfamily feature a symmetric antiparallel beta-sheet and bind cooperatively as (RHH2)2 or RHH2-oligomers to the major groove of ~50° bent palindromic operators. As a member of this family, the Streptococcus pyogenes plasmid pSM19035 encoded Omega regulates transcription of genes required for copy number control and stable maintenance of inc18 family plasmids. Omega dimers (Omega2) bind cooperatively to promoters consisting of 7 to 10 consecutive non-palindromic heptad repeats (5 -A/TATCACA/T-3 , symbolized by ->) in palindromic inverted (-><-) or (<\-->) orientation and also uniquely to non-palindromic direct (->->) repeats. This work presents crystal structures of N-terminally truncated Omega-Repressor (∆19Omega2) bound to nearly straight B-form minimal operators with (->->) and (-><-) repeats. Since the pseudo-twofold axis relating the monomers in ∆19Omega2 passes the central CG base-pair of each heptad with ~0.3 Å downstream offset, the separation between the pseudo- twofold axes is 7 base-pairs in (->->), ~0.6Å shorter in (-><-) but ~0.6 Å longer in (<\-->). These variations grade interactions between alpha1-helices of adjacent ∆19Omega2 and explain the sixfold reduced affinity for the binding of ∆19Omega2 to (<\-->) compared to strong binding to heptads in (->->) or (-><-) arrangements. The different dimer-dimer interactions contribute to modulations in cooperative binding affinity of Omega2 to natural operators with different heptad orientations. Biochemical studies revealed, that the probably unstructured N-terminus of Omega-Repressor binds to the ParA homologous Delta-Protein and stimulates its ATPase activity. Delta-Protein is involved in active partitioning of plasmid pSM19035 during cell division. This result indicates, that Omega-repressor is the missing ParB partner of known ParA/ParB systems involved in plasmid partitioning. Further studies in cooperation with Aslan Cicek will employ cryo-electron microscopy to study nucleoprotein complexes formed between Operator-DNA, Omega-Repressor and Delta-Protein.