Untersuchungen zur Pathogenese der neurologischen Form der EHV-1 Infektion des Pferdes unter Einbeziehung von EHV-4 und -9 und besonderer Berücksichtigung von zirkulierenden Immunkomplexen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur neurologischen Verlaufsform der EHV-1 Infektion des Pferdes durchgeführt. Hierzu wurde zum einen die Bedeutung zirkulierender Immunkomplexe untersucht und zum anderen der Gewebetropismus von EHV-1 im zentralen Nervensystem bei Pferden und zum Vergleich bei Mäusen untersucht. Die Diagnostik von EHV-9 und der Vergleich dieses neurotropen Virus mit EHV-1 und EHV-4 war weiterer Bestandteil der Arbeit. Die Bedeutung von zirkulierenden Immunkomplexen wurde anhand von 102 Serumproben von Pferden mit und ohne herpesbedingte neurologische Erkrankung analysiert. Die Immunkomplexe konnten mithilfe eines von mir aufgebauten ELISAs gemessen werden. Es wurde gezeigt, dass bei Pferden mit hohen Antikörpertitern gegen EHV-1 auch signifikant häufiger zirkulierende Immunkomplexe gemessen werden können. Es gab dabei keinen Zusammenhang zwischen den Tieren mit vorberichtlicher „Ataxie“ und den Tieren ohne neurologische Erkrankung. In Bezug auf die Impfung von Pferden gegen EHV-1/-4 zeigte sich, dass bei den geimpften Tieren mit hohen NT-Antikörpertitern häufig zirkulierende Immunkomplexe nachzuweisen sind, der Unterschied zu den nicht geimpften Tieren mit hohen NT-Antikörpertitern ist jedoch statistisch nicht relevant. Zudem konnte dargestellt werden, dass es mit zunehmendem Alter der Pferde auch eine Zunahme der IC positiven Tiere gibt. Auch wenn der Nachweis von zirkulierenden Immunkomplexen im Blut von Pferden anhand der hier untersuchten Proben erstmal keinen konkreten Zusammenhang mit der neurologischen Verlaufsform der EHV-1 Infektion zeigte, sollte in Folgestudien deren Bedeutung weiterführend untersucht werden. Hier wäre z. B. der in situ Nachweis von Immunkomplexen direkt in den betroffenen Endothelgeweben des zentralen Nervensystems von Interesse. In weiteren Untersuchungen zur Bedeutung von zirkulierenden Immunkomplexen könnte die genauere Bedeutung von EHV- 4, sowie ein insgesamt größere Probenzahl aufschlussreiche Ergebnisse liefern. Bei den Untersuchungen zum Tropismus von EHV-1 in Geweben des zentralen Nervensystems konnte EHV-1 mit der PCR in Teilen des Gehirns sowie des Rückenmarks gefunden werden. Bei den Pferden mit dem Verdacht auf die neurologische Form der EHV-1 Infektion war der Virusgenomnachweis bei 21 von 49 Proben positiv. Bei den 63 untersuchten Proben von nicht erkrankten Schlachthofpferden konnte in keinem Fall EHV-1 im ZNS nachgewiesen werden. Bei den experimentell infizierten Pferden konnte EHV-1 auch mit der in situ–Hybridisierung im ZNS gezeigt werden. Dabei konnte der Endotheliotropismus für EHV-1 bestätigt werden. Bei den experimentell infizierten Mausgeweben war sowohl mit der PCR, als auch der ISH EHV-1 in ZNS Geweben zu detektieren. Hier konnte in 9 von 20 Proben per PCR und in 6 Gewebeschnitten mit der in situ-Hybridisierung EHV-1 DNA detektiert werden. Ein Endotheliotropismus war hier nicht zu bestätigen, vielmehr fand eine multifokale Infektion neuronalen Gewebes statt. Bei den 2 untersuchten Feten konnte im ZNS sowohl ein Endotheliotropismus, als auch die multifokale Infektion von neuronalen Zellen gezeigt werden. EHV-4 konnte in den Untersuchungen zum Gewebetropismus in keinem Fall im Zusammenhang mit der neurologischen Verlaufsform der EHV-Infektion gefunden werden. Das equine Herpesvirus 9 wurde im Vergleich zu EHV-1 und EHV-4 untersucht. Dabei zeigten sich Unterschiede im Wachstumsverhalten von EHV-9 zu EHV-1 insbesondere auf Vero- und JK Milzzellen. EHV-4 war im Wachstumsverhalten am deutlichsten von den anderen beiden Viren abzugrenzen. Die REA konnten feine Unterschiede von EHV-9 und EHV-1 im Restriktionsenzymmuster zeigen. Mit der Kombination von EHV-9- und EHV-1 PCR war eine Abgrenzung dieser beiden Viren voneinander erfolgen. Alle drei hier aufgeführten Untersuchungen zu dem neurotropen Virus EHV-9 zeigen dessen nahe Verwandtschaft zu EHV-1 und grenzt es deutlich ab von EHV-4.

In the presented thesis investigations were carried out on EHV-1 associated neurological disease in horses. The relevance of circulation immune complexes and the tropism of EHV-1 in tissues of the central nervous system in horses and in mice were analyzed. Furthermore the diagnostic on EHV-9 was part of this study and the comparison of this neurotropic virus with EHV-1 and EHV-4. Blood serum samples of 102 horses were investigated for EHV-1 related circulation immune complexes (CIC) by ELISA assay. Horses with high antibody titer in neutralization test showed a significant higher amount of CIC in blood samples. The detection of CIC in horses with equine herpesvirus associated neurological disease in comparison to non neurological affected horses showed no significant difference. There was a moderate increase of CIC in horses regularly vaccinated against EHV-1/-4 if compared with non vaccinated animals. In young horses the detection of CIC was much lower than in older horses, but the increase of CIC in older animals was only moderate. Even though in this study circulation immune complexes could not be directly associated with herpesvirus myeloencephalopathy further studies should be taken on a more extensive number of samples. Focus could be laid on the in situ detection of CIC in central nervous system tissues and a determination of EHV-1 and EHV-4 circulating immune complexes. EHV-1 DNA could be detected in tissues of the central nervous system of horses by polymerase chain reaction. In horses with EHV-1 associated neurological disease 21 of 49 samples of CNS tissues were positive for EHV-1 by PCR. In 63 CNS probes of non neurological affected horses no EHV-1 could be found. By in situ hybridization technique in experimental infected horses endotheliotropism of EHV-1 in CNS could be shown. EHV-1 infected mouse tissues showed no endotheliotropism but a multifocal infection of neurons in CNS. In 9 of 20 tissue samples EHV-1 DNA was found by PCR and in 6 samples by in situ hybridization. In two aborted foetuses due to an EHV-1 infection of the mares the virus could be detected in both, neurons and in endothelial cells of the CNS. EHV-4 was not detected in any of the investigated samples. The neurotropic virus EHV-9 was compared with the viruses EHV-1 and – 4. On Vero- and JK spleen cells EHV- 9 and EHV-1 showed differences in respect to their growing behaviour. EHV-4 showed a complete different behaviour regarding growing behaviour compared to the other viruses. By restriction enzyme analyses EHV-9 and EHV-1 showed only small differences in restriction pattern. EHV-9 – and -1 polymerase chain reaction in combination offered another possibility to detect EHV-9 DNA and distinguish it from EHV-1. The investigation on EHV-9 showed the close relation of this virus to EHV-1 and demarcates it from EHV- 4.