Funktionelle Charakterisierung der pollenspezifischen NAD(P)H-Oxidasen RBOHH und RBOHJ

Abstract

Sexuelle Reproduktion in Blütenpflanzen erfordert die Ausbildung eines Pollenschlauchs, der die immotilen Spermien zu dem weiblichen Gametophyten transportiert. Pollenschläuche sind extrem polarisierte Zellen und aufgrund dieser Eigenschaft und ihrer fundamentalen Bedeutung für die Reproduktion, gelten sie als wichtiges Modellsystem für die Untersuchung von polarem Zellwachstum und Signaltransduktion. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), synthetisiert von NAD(P)H-Oxidasen, sind bekannt als Regulatoren des Pollenschlauchwachstums, jedoch ist deren genaue Funktion während dieses Prozesses noch unklar. In dieser Arbeit wurde die Funktion der pollenspezifischen NAD(P)H-Oxidasen näher untersucht. Die Modellpflanze Arabidopsis thaliana verfügt über zwei spezifisch in Pollen exprimierte NAD(P)H-Oxidasen, RBOHH und RBOHJ. Durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Fluoreszenzmarkierte RBOHH und RBOHJ in distinkten und überlappenden Plasmamembranregionen lokalisiert sind. Die Plasmamembranlokalisation von RBOHH und RBOHJ war sensitiv gegenüber dem Exozytose-Inhibitor BFA, was daraufhin deutet, dass beide Enzyme während des Pollenschlauchwachstums kontinuierlich rezykliert werden. Funktioneller Verlust von RBOHH und RBOHJ in homozygoten Doppelmutanten führt zu einer erheblichen Verringerung der Fertilität, was durch einen Defekt im männlichen Gametophyten verursacht wird. Pollen von rbohh rbohj - Doppelmutanten kann zwar in vitro und in vivo keimen, jedoch kollabiert ein Großteil der Pollenschläuche während der Elongation. Eine Analyse der Pollenschlauchwachstumsdynamik offenbarte signifikante Unterschiede zwischen WTund rbohh rbohj -Pollenschläuchen: Während WT-Pollenschläuche mit gleichmäßiger Geschwindigkeit wachsen, oszilliert die Wachstumsgeschwindigkeit bei rbohh rbohj -Mutanten. Durch Lebendzellanalyse der Exozytosedynamik konnte gezeigt werden, dass diese Oszillationen durch ein Ungleichgeweicht zwischen Zellexpansionsrate und Exozytoserate verursacht wird. Die Wachstumsoszillationen in rbohh rbohj gingen einher mit einer verstärkten Oszillation der intrazellulären Ca2+-Konzentration, d. h. es besteht mit hoher Wahrscheinlichkeit ein kausaler Zusammenhang zwischen Wachstum und Ca2+-Einstrom. Anhand dieser Ergebnisse wird ein Modell vorgeschlagen, in dem ROS und Ca2+ eine einfache Rückkopplungsschleife konstituieren. Es wird postuliert, dass Wachstum Ca2+-Einstrom induziert und damit ROS-Produktion aktiviert, wodurch wiederum das Wachstum gebremst wird. Die Amplitude der intrinsischen Wachstumsoszillation wird dadurch verkleinert und das Wachstum stabilisiert. Die hier vorgestellten Daten repräsentieren einen wichtigen Beitrag für das Verständnis des polaren Zellwachstums.

Sexual reproduction in flowering plants involves the formation of a pollen tube, an extremely polarized cell, which delivers the immotile male germ unit to the female gametophyte. Pollen tubes have proven to be an excellent model system for studying various aspects of polarized cell growth such as Ca2+- or small GTPase-signaling. Reactive oxygen species (ROS) produced by NAD(P)H oxidases have long been recognized as important factors during pollen tube growth, however, their precise function during this process has remained largely unknown. In this work, the biological function of pollen-expressed NAD(P)H oxidases was further explored. The model plant Arabidopsis thaliana has two pollenspecific NAD(P)H oxidase isoforms, RBOHH and RBOHJ, which have overlapping functions during pollen tube growth. Confocal laser scanning microscopy of pollen tubes expressing fluorescently labelled NAD(P)H oxidases showed that RBOHH and RBOHJ are located at overlapping and distinct plasma membrane regions. Both enzymes were internalized after application of the exocytosis inhibitor Brefeldin A, albeit with different kinetics, indicating that RBOHH and RBOHJ are continouusly recycled during pollen tube elongation. Genetic loss of RBOHH and RBOHJ in homozygous double mutants severely compromises plant fertility, which is caused by a male gametophytic defect. Although rbohh rbohj double mutant pollen was able to germinate, the resulting pollen tubes prematurely collapsed, significantly affecting fertilization. Using kinematic analysis of growing pollen tubes, it is further shown that rbohh rbohj pollen tubes have altered growth dynamics. Life cell imaging of exocytic dynamics in growing pollen tubes revealed that these alterations are most likely caused by an imbalance between the rate of cell expansion and the rate of exocytosis. The enhanced growth oscillations of rbohh rbohj pollen tubes are accompanied by growth dependent Ca2+-oscillations which do not occur in WT. Based on these findings a model is proposed in which NAD(P)H oxidase produced ROS and Ca2+ comprise a simple feedback loop that dampens the amplitude of intrinsic growth rate oscillations thus stabilizing growth. These findings not only elucidate the function of ROS during pollen tube growth, but have also profound implications for other processes involving NAD(P)H oxidases.