Charakterisierung der Expression ausgesuchter Kandidatengene in Uterus und Plazenta des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus): ein Modell für feto-maternale Interaktionen

Abstract

Der Uterus und die Plazenta der Säugetiere spielen entscheidende Schlüsselrollen im Reproduktionsgeschehen. Sie stellen im Idealfall optimale Bedingungen für die Implantation und die weitere Entwicklung der befruchteten Eizelle zur Verfügung und ermöglichen mit der erfolgreichen Fortpflanzung die Grundvoraussetzung für das Fortbestehen einer Art. Viele der lokal ablaufenden Prozesse werden (potentiell) durch Östrogene, NO-Synthasen und Wachstumsfaktoren beeinflusst und reguliert. Insbesondere den Wachstumsfaktoren wird eine bedeutende Rolle im Fortpflanzungsgeschehen zugeschrieben. Man vermutet, dass sie einen entscheidenen Einfluss auf die ideale Entwicklung und das Größenwachstum des ungeborenen Fetus haben. Gleichzeitig ist bekannt, dass besonders das IGF-System große tierartliche Unterschieden aufweist. Dem NO-System wird einerseits eine Ruhigstellung des Myometriums während einer Trächtigkeit zugeschrieben (epitheliale NO- Synthase), andererseits haben Forscher die These aufgestellt, die induzierbare NO-Synthase sei maßgeblich an der Menstruation des Menschen und vielleicht auch an der Implantation des Konzeptus beteiligt, da beide Vorgänge Charakteristiken entzündlicher Prozesse zeigen. Die maßgebliche Steuerung beider Organe durch Steroidhormone wurde bereits mehrfach bewiesen. Um einen ersten Einblick in die Expressionsprofile des Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), eines vielfach in der Reproduktionsforschung als Modelltier für den Menschen genutzten Tieres, zu erlangen, wurde zunächst versucht, die Faktoren von Interesse in unterschiedlichen callithrichiden Homogenaten nachzuweisen, um anschließend die zyklus- und hormonabhängigen globalen Veränderungen der mRNA-Expression in Uterus und Plazenta exemplarisch zu untersuchen. Das Untersuchungsmaterial wurde nach der Entnahme kryokonserviert und für diese Arbeit von Frau Prof. Einspanier, Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig, Veterinär-Physiologisch-Chemisches Institut, zur Verfügung gestellt. Es handelte sich dabei um halbierte Gesamt-Uteri zu unterschiedlichen Zykluszeitpunkten, von denen einige der Tiere vor der Organentnahme mit den Hormonen FSH oder hCG behandelt wurden, zwei Schleimhautstanzen sowie drei Plazenten, die während geplanter Sectiones caesareae und einer natürlichen Geburt gewonnen wurden. Bei den Organen konnte mittels Real-Time-PCR jeder der untersuchten Faktoren (ER-a, ER-b, eNOS, iNOS, IGF-1, IGF-2, IGF1-R, IGFBP-1 sowie IGFBP-2) nachgewiesen und mRNA- Expressionsunterschiede quantitativ gemessen werden. Zur Normalisierung der Ergebnisse wurden zudem die Housekeepingfaktoren Ubiquitin und 18 S-rRNA einbezogen. Transkripte aller untersuchten Faktoren konnten in allen Proben nachgewiesen werden, die entsprechenden Genabschnitte wurden erfolgreich sequenziert. Die neuen Sequenzen wurden mit bereits vorliegenden anderen callithrichiden oder humanen Sequenzen verglichen und zeigten zu diesen jeweils ein hohes Maß an Homologie. Die hier vorliegende Studie ist eine der ersten, die einen direkten Vergleich der Genexpression zwischen Uterus und Plazenta beim Weißbüschelaffen anstellt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Faktoren in den zwei unterschiedlichen Organen Uterus und Plazenta unabhängig voneinander exprimiert werden. Während die Expression der Housekeepinggene 18 S-rRNA und Ubiquitin in beiden Organen keine deutliche Diskrepanz zeigt, bestehen vor allem für die Faktoren ER-a, eNOS, IGF-1, IGF-2 und IGF1-R deutlich Expressionsunterschiede zwischen Plazenta und Uterus. Faktoren wie eNOS und IGF-1 zeigen eine deutlichere Zyklusdynamik als beispielsweise IGF-1, IGF1-R, IGFBP-1 und IGFBP-2, deren Expression teilweise trotz Normalisierung recht inhomogen war. Besonders bei den Faktoren iNOS und IGFBP-1 war die Anzahl der gemessenen Transkripte sehr gering und nahe der Nachweisgrenze, so dass bei diesen Faktoren davon ausgegangen werden muss, dass bereits minimale Veränderungen im Organismus des Donortieres eine augenscheinlich massive Variation des Messwertes im untersuchten Organ zur Folge haben kann. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt sich folgern, dass im Uterus und in der Plazenta des Weißbüschelaffen ein in vielen Faktoren ähnliches, nicht jedoch identisches, bei einigen Faktoren auch stark differierendes Expressionsprofil im Vergleich mit der Frau vorliegt. Die zyklus- und trächtigkeitsabhängig regulierten Faktoren lassen vermuten, dass sie am Reproduktionsgeschehen entscheidenden Einfluss nehmen. Es kann folglich davon ausgegangen werden, dass die NO-Synthasen ebenso wie das IGF-System, wie bereits bei anderen Tierarten gezeigt, auch beim weiblichen Weißbüschelaffen eine essentielle Rolle bei der Reproduktion spielen. Ob und inwieweit sich Callithrix jacchus in Bezug auf diese Faktoren als Modelltier für die Reproduktionsforschung bei der Frau eignet, ist differenziert zu sehen und muss in weiteren Studien präzisiert werden.

In mammals uterus and placenta play a pivotal role in reproduction. Ideally they provide the optimal environment for the implantation and the further development of the fertilized zygote and build the foundation of the survival of a species by making successful breeding possible. Many of the locally occuring processes are potentially influenced/affected or even regulated by estrogens, NO-synthases and growth factors. Especially the growth factors are meant to play an important role in reproduction. It is assumed that they have a crucial influence on the ideal development and process of growth in the unborn fetus. At the same time it was experimentally verified that especially the insulin-like growth factor-system shows ample differences between species. The NO-System on the one handis meant to be involved in uterine quiescence of the myometrium during pregnancy (eNOS), on the other some scientists hypothesize that iNOS play a substantial role in human menstruation and may participate in implantation since both processes show elements of inflammatory events. The control of both organs by steroid hormones has been scientifically proven many times. To provide a first insight into the expression profiles of the marmoset Callithrix jacchus, a common model in reproductive research, initially the interesting factors were detected in tissue-homogenates of Callithrix jacchus. Afterwards the cycle and hormonally dependent global changes of mRNA-expression in uterus and placenta were examined exemplarily. To accomplish this, the harvested organs have been cryopreservated and been made available to me by our cooperational partner, Prof. Almuth Einspanier, Veterinary Faculty of Leipzig University. The organs were bisected whole uteri at different stages of the mentrual cycle, some of them treated with the hormones FSH or hCG prior to harvesting, two endometrial punches and three placentae at term (timed sectiones caesareae and one natural birth). By using real-time-PCR it was possible to detect and quantify all examined factors (ER-a, ER-b, eNOS, iNOS, IGF-1, IGF-2, IGF1-R, IGFBP-1 and IGFBP-2) in the used organs. To be able to perform a normalization of the results, the housekeeping genes ubiquitin and 18 S-rRNA were also included into the study. Transcripts of all examined factors have been detected in all the tested organs, the corresponding gene segments have been successfully sequenced. The newly sequenced cDNA-templates were matched to corresponding callithrichid or human sequences and always showed similarities to a large extent. This present study is one of the first drawing a direct comparison of the genetical expression between the uterus and placenta of the marmoset. The results clearly show that the examined factors are differently expressed within the two organs uterus and placenta. While the expression of the housekeeping genes ubiquitin and 18 S-rRNA does not show a distinct discrepancy between the two types of organs, especially the factors ER-a, eNOS, IGF-1, IGF-2 and IGF1-R show a very marked variation between placenta and uterus. The factors eNOS und IGF-1 showed a clearer dynamic in the estrous cycle than for example those of the factors IGF-1, IGF1-R, IGFBP-1 and IGFBP-2, whose expression stayed quite inhomogeneous even despite normalization. Especially for the factors iNOS and IGFBP-1 the number of transcripts was exeptionally low and close to our detectionable limits, therefore it has to be assumed that even minor changes in the intact living organism of the donor may lead to apparent variations in measurement in the examined organ. This study leads to the result that uterus and placenta of the marmoset show an expressional profile that in some aspects resembles the human profile without being identical, but in others also varies distinctively from that of the human woman. The cycle- and pregnancyregulated factors lead to the hypothesis that they are playing a major role in reproduction. Therefore it can be concluded that the NO-synthases and the IGF- system, as has already been shown in other species, also play an important role within the reproduction of the marmoset monkey. To validate the marmoset as a model for human reproduction on this factors, more differenciated studies are needed to define their role more precisely.