Die Bedeutung von Bcl-2-Proteinen für die Regulation der Apoptose beim malignen Melanom

Abstract

Ein entscheidendes Charakteristikum von Krebszellen ist ihre Apoptosedefizienz, aufgrund von welcher unkontrolliert wachsende Zellen nicht mehr eliminiert werden können. Bei der mitochondrial vermittelten Apoptose stellen die Mitglieder der Bcl-2-Familie wichtige Regulatoren dar. In den hier untersuchten Melanom-Zelllinien zeigte sich im Vergleich zu normalen Melanozyten-Kulturen eine relativ hohe Expression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-XL, während das proapoptotische Bcl-XS auf Protein- Ebene nicht zu detektieren war. Melanom-Zelllinien, die sich resistent gegenüber der agonistischen CD95-Stimulation (CH-11) sowie gegenüber Ceramid verhielten, waren durch ein relativ hohes Mengenverhältnis von Bcl-2 zu Bax charakterisiert. Die besondere Bedeutung der Bcl-2-Proteine wurde in zwei für CH-11 und Ceramid sensitiven Melanom-Zelllinien bestätigt, wo stabile Überexpression von Bcl-2 Resistenz gegenüber Apoptose-Stimuli vermittelte. Zur Untersuchung der Rolle von Bcl-XS und Bcl-XL bei der Regulation der Apoptose in Melanom-Zellen wurden beide Gene mittels RT-PCR kloniert und in einem durch Tetrazyklin regulierbarem System zur Expression gebracht. Im Zuge der Klonierung konnte außerdem eine neue Spleissvariante mit einem Molekulargewicht von 18 kDa von bisher ungeklärter Funktion identifiziert werden. Die Induktion von Bcl-XS in stabil transfizierten Melanomzell-Klonen führte zu einer signifikanten Steigerung der Apoptose, während Überexpression von Bcl-XL die basale Apoptoserate erniedrigte. Bei der Untersuchung des Mechanismus der durch Bcl-XS-vermittelten Apoptose zeigte sich nach Bcl-XS- Überexpression eine deutliche Abnahme des Gehaltes an Cytochrom C in den Mitochondrien, jedoch war keine Erhöhung des cytoplasmatischen Gehalts an Cytochrom C feststellbar. Auch eine Aktivierung der Caspasen-3 und -8 zeigte sich nur schwach und transient. Interessanterweise wurde nach Induktion von Bcl-XS eine Freisetzung des "apoptosis-inducing factor" (AIF) detektiert, der seine proapoptotische Wirkung Caspasen-unabhängig entfaltet. Diese Befunde sprechen dafür, dass Bcl-XS Apoptose ohne Beteiligung von Caspasen auslöst. Die proapoptotischen Effekte verschiedener Zytostatika und anderer proapoptotischer Stimuli konnten durch Bcl-XS-Überexpression deutlich gesteigert werden. In Überprüfung der Bedeutung der Bcl-XS-Expression in vivo zeigten sich im Nacktmaus-Modell nach Induktion von Bcl-XS ein drastisch verzögertes Tumorwachstum und als Resultat um den Faktor 4,4 kleinere Tumore. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung des Verhältnisses von proapoptotischen zu antiapoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie für die Apoptose-Sensitivität von Melanom-Zellen. Die vielversprechenden Resultate im Tiermodell legen eine therapeutische Verwendungsmöglichkeit des untersuchten Bcl-XS nahe.

A decisive characteristic of cancer cells is their apoptosis deficiency due to which uncontrolled growing cells can not be eliminated. At the mitochondrial level, members of the Bcl-2 family represent important regulators of apoptosis. The melanoma cell lines, investigated, exhibited high expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-XL as compared to cultures of normal human melanocytes, whereas the proapoptotic Bcl-XS was not detectable at the protein level. Melanoma cell lines showing resistance against agonistic CD95 activation (CH-11) and against ceramide were characterised by a high ratio of Bcl-2 / Bax. The relevance of Bcl-2 proteins was confirmed in two melanoma cell lines sensitive for CH-11 and ceramide, in which stable overexpression of Bcl-2 caused resistance against apoptosis stimuli. In order to address the role of Bcl-XS and Bcl-XL in the regulation of apoptosis in melanoma cells, both genes were cloned by RT-PCR and were integrated into a tetracycline-regulatable expression plasmid system. During cloning, a novel splice variant of Bcl-X with a molecular weight of 18 kDa and a still unknown function was also identified. The induction of Bcl-XS in stably transfected melanoma cell clones resulted in a significant increase of apoptosis, whereas overexpression of Bcl-XL diminished basic apoptotic levels. Investigating the mechanism of Bcl-XS-mediated apoptosis, Bcl-XS overexpression was found to reduce the level of cytochrome c in mitochondria, but increased cytoplasmic levels of cytochrome c were not detectable. Also, activation of caspase-3 and -8 was only weak and transient. Interestingly, after Bcl-XS induction a release of the apoptosis inducing factor (AIF) was detected, which displays its proapoptotic effect independently of caspases. These results suggest that Bcl-XS mediates apoptosis without involvement of caspases. The proapoptotic effects of different cytostatic agents and other proapoptotic stimuli could be significantly increased by overexpression of Bcl-XS. Investigating the relevance of Bcl-XS overexpression in vivo, significantly delayed tumor growth was found after induction of Bcl-XS in a nude mouse model resulting in 4.4-fold smaller tumors. The present study proves the importance of the ratio of proapoptotic to antiapoptotic proteins of the Bcl-2 family for apoptosis sensitivity in melanoma cells. The promising results in the animal model may suggest a therapeutic approach based on Bcl XS.