HLA-B27 subtypes differentially associated to an autoimmune disease: analysis of peptide display and attempt to define their recognition pattern by the Killer cell Ig-like receptor KIR3DL1

Abstract

Autoimmune diseases are characterized by cellular or antibody responses against self-antigens. However, the precise role of antigens specified by the major histocompatibility complex (MHC) in these diseases, although crucial, has not been determined. In case of the human MHC gene HLA-B27 and its association with the rheumatoid disease Ankylosing Spondylitis (AS), the HLA-B27 protein itself is the strongest predisposing factor for pathogenesis. It is possible that the molecule binds self- and viral peptides in an extremely similar way (molecular mimicry) and disables distinguishing of peptides by T cells. The HLA-B*2706 subtype exhibits no association to AS and its product differs only at two amino acid positions (114 and 116) in the peptide binding groove from that of the AS-associated subtype HLA-B*2704. Similarly, the HLA-B*2703 subtype, which exhibits a questionable AS- association, differs from the ancestral, AS-associated allele HLA-B*2705 only in one residue. It is known that the self-peptide pVIPR (RRKWRRWHL) and the viral peptide pLMP2 (RRRWRRLTV) are presented in drastically different conformations by the subtypes HLA-B*2705 and HLA-B*2709 that differ only by an Asp116His exchange. The similar binding modes lead to molecular mimicry between the two peptides only when displayed by the AS-associated subtype HLA-B*2705. It is of great importance to establish whether this finding can be generalized. Therefore, a structural analysis of the HLA-B*2704/B*2706 pair of subtypes as well as a comparison of the HLA-B*2703 and HLA-B*2705 subtypes, all complexed with pLMP2 and pVIPR peptides, may be expected to shed light on this problem. The results presented here show that molecular mimicry does not occur in the B*2704 subtypes probably due to very flexible side chains of the peptide amino acids. In B*2703 subtype both peptides have clearly defined distinct binding modes, and this excludes molecular mimicry. Furthermore, the binding of interacting proteins on effector cells including killer Ig-like receptors (KIR3DL1 in case of HLA-B27) may also be influenced, and this is a further topic of the thesis. Using X-ray crystallography, we attempted to solve the structure of KIR3DL1 bound to at least one of the HLA-B27:b2m:peptide complexes whose structures had been solved previously. I produced the KIR3DL1 protein in the form of inclusion bodies in E. coli and tested a vast number of different conditions of reconstitution. The best complex was obtained for HLA-B2705 subtype with the pEBV8TvE peptide and KIR3DL1. The only microcrystal which was obtained in a crystallization process was too small for harvesting and X-ray data collection. Results presented in this study show that even a close similarity between two HLA-B27 subtypes does not allow to predict how a given peptide is bound. Additionally, it is very difficult to establish the basis for the recognition of an HLA-B27:b2m:peptide complex by KIR3DL1, and further structural analyses still must still be performed in order to understand this important interaction.

Autoimmunerkrankungen zeichnen sich durch zelluläre oder Antikörper Reaktionen gegen körpereigene Antigene aus. Jedoch die präzise Funktion der Antigene, die spezifisch für Haupt-Histokompatibilitätskomplexe (MHC) in diesen Erkrankungen sind, konnte trotzt ihrer wichtigen Rolle, noch nicht geklärt werden. Wenn es sich um die Gene HLA-B27 von menschlichen MHC und ihre Assoziation mit der Ankylosing Spondylitis (AS) handelt, bilden die Proteine einen sehr starken Veranlagungsfaktor für die Pathogenese. Es ist möglich, dass die Eigen- und Viralpeptide von MHC in sehr ähnlicher Weise gebunden werden (molekulare Mimikry), was T-Zellen eine Unterscheidung der präsentierten Peptide unmöglich macht. Der Subtyp HLA-B*2706 ist nicht AS assoziiert und seine Aminosäuresequenz unterscheidet sich von HLA-B*2704, der AS assoziiert ist, in zwei Aminosäuren (114 und 116), die sich in der Bindungsstelle des Peptides befinden. In ähnlicher Weise unterscheidet sich der Subtyp HLA-B*2703, vom ursprünglichen B*2705 Subtyp, der AS-assoziiert ist, nur in einer Aminosäure. Es konnte jedoch nicht abschließend gezeigt werden, dass der Subtyp B*2703 AS- assoziiert ist. Es ist bekannt, dass das körpereigene Peptid pVIPR (RRKWRRWHL) und das virale Peptid pLMP2 (RRRWRRLTV) von den Subtypen B*2705 und B*2709, die sich nur durch einen Asparagin zu Histidin Austausch an Position 116 unterscheiden, in äußerst unterschiedlichen Konformationen präsentiert wird. Die ähnlichen Bindungsmodi führen zur molekulare Mimikry zwischen zwei Peptiden, nur wenn sie vom AS-assoziiertem Subtyp HLA-B*2705 präsentiert werden. Es ist außerordentlich wichtig herauszufinden, ob diese Beobachtung verallgemeinert werden kann. Deshalb ist eine strukturelle Analyse der B*2704 und B*2706 Subtypen und der Vergleich von B*2703 mit dem B*2705 Subtyp, wenn sie mit den pLMP2 und pVIPR beladen sind, nötig, um Licht auf diese Fragestellung zu werfen. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass molekulare Mimikry im Subtyp B*2704 auf Grund der hohen Flexibilität der Aminosäure Seitenketten des Peptides wahrscheinlich nicht vorliegt. Im Subtyp B*2703 besitzen beide Peptide sehr unterschiedliche Bindungsmodi, und somit kann molekulare Mimikry ausgeschlossen werden. Darüber hinaus könnte die Bindung interagierenden Proteinen auf Effektorzellen, eingeschlossen dem Ig- ähnlichen Killer-Rezeptor (KIR3DL1 im Falle von HLA-B27) beeinflusst werden und dies ist ein weiterer Punkt dieser Arbeit. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse versuchten wir die Struktur eines KIR3DL1 welcher an einen HLA-B27:Peptid Komplex gebunden ist, dessen Struktur bereits bekannt ist, zu ermitteln. Ich habe das KIR3DL1 Protein in Form von Einschlusskörpern in E. coli produziert. Es wurde eine Vielzahl verschiedener Rekonstitutionsbedingungen getestet. Der beste Komplex wurde für den Subtyp B*2705, der mit dem Peptid pEBV8TvE und KIR3DL1 beladen ist, erzielt. Der einzige Mikrokristall der durch Kristallisation erhalten wurde, war allerdings zu klein, um geerntet zu werden und um kristallgraphische Daten zu sammeln. Die dargestellten Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Ähnlichkeit zwischen zwei HLA-B27 Subtypen nicht erlaubt vorherzusagen, wie das Peptid gebunden ist. Darüber hinaus, es ist sehr schwer die Grundlage der Interaktion zwischen einem HLA-B27:Peptid Komplex und KIR3DL1 zu bestimmen. Weitere Strukturanalysen müssen unternommen werden, um diesen wichtigen Prozess zu verstehen.