E-NTPDase 1 modulation of neuronal and astrocytic activity in the CNS

Abstract

Purinergic signalling is one of the most important mechanisms of neuron-glia modulation and has an essential role in the maintenance of the CNS. E-NTPDase 1 (also known as CD39) is an enzyme present in microglia which is capable of metabolizing ATP to AMP. Due to the extended ramified morphology of microglia, CD39 can be important in regulating P1 and P2 signalling in nearby neurons and astrocytes. Using a CD39 -/- mouse, we investigated the effect of CD39 on glial (microglia and astrocytes) and neuronal activity. Initial experiments with phosphate assays showed that CD39 is the only enzyme responsible for extracellular ATP and ADP dephosphorylation in microglia. Insight into glia- glia signalling (microglia-astrocytes) was acquired via experiments with astrocyte-evoked calcium waves. The calcium wave spread further in the absence of CD39, in a purine-dependent mechanism reversible by PPADS application. Furthermore, the wild type phenotype was restored by apyrase application. There was no significant effect with direct application of ATP or ARL 67156, which prevents ATP metabolization. Additionally, in CD39 -/- mice, neurons showed an increased degree of excitability, characterized by an increase of spontaneous action potentials during the repolarization phase and a higher frequency of excitatory post-synaptic events. This neuronal excitability could be mimicked by PPADS application, but not by direct application of ATP or ARL 67156. The failure to mimic the CD39 knock-out phenotype pharmacologically pointed towards deeper changes in the transgenic animal during development, which could be due to long-term adenosine mediated inhibition absent in the knock-out mouse. Taken together, the data suggest a CD39-mediation of neuronal and astrocytic activities, possibly via microglia, but the mechanism is still unknown. Considering that CD39 is important for microglia in both physio- and pathophysiological states, the neuronal and astrocytic interactions on a physiological level described in this study will ultimately allow further understanding of pathophysiology and how inflammation can modulate the CNS.

Purinerge Signalgebung ist einer der wichtigsten Mechanismen der Neuronen-Glia Interaktion und spielt eine essentielle Rolle für die Aufrechterhaltung des homöostatischen Funktionen des Zentralnervensystems. E-NTPDase 1 (auch bekannt als CD39) ist ein Enzym, welches von Mikroglia exprimiert wird und ATP zu AMP metabolisiert. An den mikroglialen Fortsätzen kann CD39 von Bedeutung sein für die Regulation der P1- und P2-Signalgebung in benachbarten Neuronen und Astrozyten. Um einen möglichen Effekt von CD39 auf gliale (Mikroglia und Astrozyten betreffend) und neuronale Aktivität zu untersuchen, verwendeten wir eine CD39 -/- Maus. Erste Untersuchungen des Phosphatmetabolismus zeigten, dass CD39 als einziges Enzym für die Dephosphorylierung von extrazellulärem ATP und ADP auf Mikroglia zuständig ist. Um jene Glia-Glia-Kommunikation (zwischen Mikroglia und Astrozyten) genauer zu studieren, untersuchte ich die Ausbreitung von Calciumwellen in Astrozyten. In Abwesenheit von CD39 auf Mikroglia breiteten sich die Calciumwellen, im Vergleich zum Wildtyp, über eine größere Fläche aus. Ich konnte zeigen, dass dieser Mechanismus purinabhängig und durch PPADS reversibel ist. Durch Zugabe von Apyrase zu Knockoutschnitten konnte ich einen Effekt ähnlich den Wildtypschnitten beobachten. Weder die Applikation von ATP noch von ARL 67156 (Blocker der ATP- Spaltung) führte zu einem signifikanten Unterschied. Des Weiteren zeigten Neurone der CD39-/- Maus eine erhöhte Erregbarkeit, charakterisiert durch eine gesteigerte Anzahl an spontanen Aktionspotentialen während der Repolarisationsphase und durch eine zunehmende Häufigkeit der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale. Diese neuronale Erregbarkeit konnte durch Applikation von PPADS nachgeahmt werden, aber nicht durch Zugabe von ATP oder ARL 67156. Die Beobachtung, dass der CD39 Knockout-Phänotyp nicht pharmakologisch nachgeahmt werden kann, weist auf mögliche Veränderungen während der Entwicklung hin. Dies geschieht möglicherweise durch langzeitige adenosinvermittelte Inhibition, die der Knockoutmaus fehlt. Zusammenfassend deuten die von mir gesammelten Daten auf eine CD39-bedingte Wirkung auf die neuronale und astrozytäre Aktivität hin, welche möglicherweise durch Mikroglia vermittelt wird. Ein genereller Mechanismus ist allerdings noch nicht bekannt. CD39 ist sowohl in einem physiologischen als auch in einem pathophysiologischen Kontext für Mikroglia wichtig. Die hier vorgestellte neuronale und astrozytäre Interaktion in der physiologischen Ebene können somit dazu beitragen, die Pathophysiologie und die Entzündungsprozesse im ZNS besser zu verstehen.