Isolierung, Charakterisierung und Kultivierung humaner Hepatozyten und nicht- parenchymaler Leberzellen für pharmakologische Untersuchungen

Abstract

Untersuchungen an primären humanen Hepatozyten (PHH) gelten als der Goldstandard für die Analyse von Fremdstoffmetabolismus und Hepatotoxizität in vitro. PHH Monokulturen sind jedoch in ihrer Lebensdauer und Funktionalität stark limitiert. Komplexe Wirkungsmechanismen können nur unzureichend abgebildet werden. Hepatische nicht-parenchymale Zellen (NPC), wie Kupffer- Zellen (KC), Leberendothelzellen (LEC) und hepatische Sternzellen (HSC) spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der PHH-Funktionen, sowie bei regenerativen und pathophysiologischen Vorgängen der Leber. Zur Entwicklung funktionaler und reproduzierbarer in vitro Lebermodelle ist die Verfügbarkeit von parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen in definierter Qualität und Quantität unverzichtbar. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines Protokolls für die parallele Isolierung von humanen PHH und NPC aus dem Lebergewebe eines Donors, sowie die Untersuchung zellspezifischer Eigenschaften für eine potenzielle Nutzung der Zellen in in vitro Lebersystemen. Humane PHH und NPC wurden aus gesundem Lebergewebe nach partieller Leberresektion durch eine Zwei - Schritt EDTA / Kollagenase- Perfusions Technik isoliert. Die erhaltenen Zellfraktionen wurden durch Percoll-Dichtegradientenzentrifugationen gereinigt und durch spezifische Adhärenzeigenschaften, sowie eine magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS®) separiert. KC, LEC und HSC wurden identifiziert und in Monokulturen kultiviert. Anhand zelltypspezifischer Eigenschaften wurden das Verhalten und die Stabilität der NPC in Kultur charakterisiert. Pro Gramm Lebergewebe konnte eine Ausbeute von 1,9 x 106 KC, 2,7 x 105 LEC und 4,7 x 105 HSC, mit einer Viabilität von > 90% erzielt werden. Die funktionelle Charakterisierung der NPC zeigte eine Aktivierung aller Zellpopulationen in Kultur. Eine Aktivierung der KC, gepaart mit einem starken Viabilitätsverlust wurde innerhalb von 4 - 5 Tagen registriert. Die LEC verloren in Kultur zellspezifische Besonderheiten, während die HSC einen Transformationsprozess in einen Myofibroblasten ähnlichen Zelltyp durchliefen. Die Untersuchung verschiedener Kulturbedingungen für HSC zeigte, dass eine Dedifferenzierung der Zellen in vitro abgeschwächt, aber nicht vollständig verhindert werden konnte. Das beschriebene Verfahren ermöglicht erstmals eine gleichzeitige Isolierung und Trennung von humanen PHH und NPC in hoher Qualität und Ausbeute.

Use of primary human hepatocytes (PHH) is considered to be the gold standard for the in vitro study of drug metabolism and hepatotoxicity. PHH monocultures are quite limited in its life and functionality. Complex mechanisms of action can only be displayed insufficiently. Hepatic non-parenchymal cells (NPC) as Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic stellate cells (HSC) play a central role in maintaining the PHH functions, as well as in regenerative and pathophysiological processes of the liver. To develop functional and reproducible in vitro liver models, the availability of parenchymal and non-parenchymal liver cells in a defined quality and quantity is essential. The aim of the present study was to establish a protocol for the parallel isolation of human PHH and NPC from the liver tissue of one donor, and the study of cell-specific properties for a potential use of those cells in in vitro liver systems. Human PHH and NPC were isolated from healthy liver tissue following partial hepatectomy by a two - step EDTA / collagenase perfusion technique. The obtained cell fractions were purified by a Percoll density gradient centrifugation and separated by specific adherence properties and a magnetically activated cell sorting (MACS®). KC, LEC and HSC were identified and cultured in monocultures. Using cell-type specific properties the behavior and stability of NPC were characterized in culture. Per gram of liver tissue there was a yield of 1.9 x 106 KC, 2.7 x 105 LEC and 4.7 x 105 HSC achieved, with a viability of > 90%. Functional characterization of NPC showed an activation of all populations in culture. Activation of the KC, coupled with a strong lost of viability was registered within 4 - 5 days. LEC lost in culture cell-specific characteristics, while HSC underwent a process of transformation into a myofibroblastlike cell type. The study of different culture conditions for HSC showed that the dedifferentiation of the cells was attenuated in vitro, but could not be completely prevented. The procedure described allows the simultaneous isolation and separation of human PHH and NPC in a high quality and yield.