dc.contributor.author
Toepfer, Cornelia
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:04:49Z
dc.date.available
2002-10-02T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10014
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14212
dc.description
0 Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Synaptische Signaltransduktion
1.2 Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors
1.3 Bisher bekannte Teilstrukturen von anderen Ionenkanälen
1.4 Aufgabenstellung: Untersuchung der Struktur einer Proteindomäne
2 Ergebnisse
2.1 Nachweis der erfolgreichen Expression der intrazellulären Domäne
2.2 Expression in Insektenzellen
2.3 Expression in Escherichia coli
2.4 Expression in zellfreien Systemen
3 Diskussion der Ergebnisse
3.1 Expression in Sf9-Insektenzellen
3.2 Expression in E. coli
3.3 In vitro-Expression
3.4 Ausblick
4 Zusammenfassung
5 Summary
6 Material und Methoden
6.1 Methoden zur Proteinbestimmung
6.2 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
6.3 Western Blot
6.4 Molekularbiologische Methoden
6.5 Proteinexpression in E. coli
6.6 Zellkultur von Sf9-Insektenzellen
6.7 Indirekte Immunfluoreszenz von transfizierten Zellen
6.8 Membranpräparation aus transfizierten Zellen
6.9 Reinigung von exprimierten Proteinen
6.10 In vitro-Expression
6.11 Massenspektrometrische Analyse von Peptiden
6.12 Peptidsequenzierung nach Edman
6.13 Materialien
7 Literaturverzeichnis
8 Anhang
8.1 Vektorkarten und verwendete Sequenzen
8.2 MALDI-Komplettspektrum
8.3 MALDI-PSD-Spektrum
8.4 Abkürzungen und Einheiten
8.5 Eigene Veröffentlichungen
8.6 Lebenslauf
8.7 Danksagung
dc.description.abstract
Um die Funktion von ligandengesteuerten Ionenkanälen besser verstehen zu
können, muss ihre Struktur in einer Auflösung im Bereich von wenigen Å bekannt
sein. Da es sich bei diesen Rezeptoren um sehr komplexe Membranproteine
handelt, war eine Kristallisation und anschließende Röntgenstrukturanalyse
bisher nicht möglich. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein anderer
Ansatz verfolgt, die Struktur des nikotinischen Acetylcholinrezeptors weiter
aufzuklären. Die intrazellulären Domänen der alpha-, beta-, gamma- und delta-
Untereinheiten des Rezeptors aus Torpedo californica und des alpha7-Rezeptors
aus Ratte sollten in verschiedenen Systemen exprimiert werden, um die Struktur
dieser Domänen untersuchen zu können. Eine Untersuchung der intrazellulären
Domänen ist für die Neurochemie unter anderem deshalb von Bedeutung, weil ihre
Beteiligung an der intrazellulären Signalweitergabe wahrscheinlich ist. Bisher
gibt es über alle Bereiche des Acetylcholinrezeptors Daten oder zumindest
Modelle zu ihrer Struktur, es ist aber noch nichts über die intrazellulären
Schleifen bekannt. Diese Schleifen besitzen bei einigen Untereinheiten
Phosphorylierungsstellen, und durch Mutationsexperimente wurde ihre
Wichtigkeit für das Clustering des Acetylcholinrezeptors an der
postsynaptischen Membran gezeigt. Als eukaryontisches Expressionssystem wurde
die Sf9-Insektenzellkultur verwendet. Einerseits über das Baculovirus-System,
andererseits über direkte Transfektion wurden verschiedene DNA-Konstrukte in
die Zellen gebracht. Die Baculovirus-Expression war für die Herstellung der
gesuchten Proteine nicht geeignet, weil die Insektenzellen zu schnell starben,
um ausreichende Mengen zu exprimieren. Außerdem sind die Prozeduren zur
Herstellung der Baculoviren zu zeitaufwendig, um eine größere Zahl von DNA-
Konstrukten für die Optimierung der Proteinexpression zu testen. Eine stabil
transfizierte Zelllinie, die die intrazelluläre Schleife der delta-
Untereinheit exprimiert, wurde etabliert. Mit diesen Zellen wurde eine
Reinigungsprozedur für das exprimierte Protein ausgearbeitet. Diese Methode
kann weiter optimiert werden, um ausreichende Mengen des gesuchten Proteins zu
erhalten. Desweiteren wurden mehrere DNA-Konstrukte für verschiedene
Fusionsproteine im prokaryontischen Expressionssystem E. coli versucht zu
exprimieren. Von den intrazellulären Schleifen der delta- und der
alpha7-Untereinheit wurden trunkierte Versionen in unterschiedliche Vektoren
eingebracht. Für einige der Konstrukte konnte eine gute Expression erreicht
werden, allerdings ließ sich das Protein meist nicht ohne Verwendung von hohen
Konzentrationen an Detergenz aufreinigen. Das GST-Fusionsprotein der
alpha7-Schleife konnte schließlich aus Bakterien mit einer Konzentration von
30 µg/ml isoliert werden. Als weitere Methode wurde die zellfreie Expression
mit zwei In vitro-Systemen der Firmen Roche und RiNA getestet. Es wurden
mehrere Expressionsversuche mit verschiedenen intrazellulären Schleifen
durchgeführt. In einem Ansatz konnte erfolgreich die intrazelluläre delta-
Schleife in kleiner Menge exprimiert und durch Ni2+-Affinitätschromatographie
angereichert werden. Die Ausführungen zeigen, dass die Expression in
zellfreien Systemen insbesondere von problematischen Proteinen für weitere
Untersuchungen parallel zu anderen Expressions-Methoden in Betracht zu ziehen
ist. Um für Strukturuntersuchungen ausreichende Proteinmengen der
intrazellulären Domänen des nAChR zu erhalten, sind die in der vorliegenden
Arbeit gezeigten Methoden entsprechend weiter zu optimieren.
de
dc.description.abstract
For understanding the function of ligand-gated ion channels at a molecular
level, the structure of such channels at a few Å-resolution has to be known.
Since these receptors are complex membrane proteins, crystallization and
follow-up x-ray structure analysis of these channels was not possible up to
now. Therefore, a different approach to further clarify the structure of the
nicotinic acetylcholine receptor is presented in this thesis. To examine the
structure of these domains, it was intended to express some of the receptor's
intracellular domains in different cellular systems. Due to their likely
participation in intracellular signal processing, studying these intracellular
domains is of great value for neurochemical studies. For the rest of the
receptor molecule, data and modellings of the structure are published but
nothing is known about the intracellular loops. The loops contain for example
phosphorylation sites in certain subunits, which are important for clustering
of acetylcholine receptors at postsynaptic membranes, as mutation experiments
had shown. Sf9-insect cells were used as eukaryotic expression system.
Different DNA constructs were introduced into cells by baculovirus systems as
well as by transfection with lipid reagents. The baculovirus expression
however did not prove to be suitable for expressing the desired proteins.
After infection the insect cells died before the expression of sufficient
amounts of protein could be observed. In addition, the viral procedure is far
too time consuming to test a large number of DNA constructs for optimizing the
protein expression. Finally, a stable Sf9 cell line was established that
expresses the intracellular loop of the delta-subunit. By using these cells, a
procedure to purify the expressed delta-loop was developed. This procedure may
be used to optimize the expression in order to obtain protein amounts
sufficient for structural studies. In E. coli, the expression of the
intracellular loop in a prokaryotic context was tested for several DNA
constructs encoding fusion proteins with soluble proteins like GST. Truncated
versions of the intracellular loops of the delta- and the alpha7-subunits were
in-troduced in different vectors. For some constructs a satisfying expression
was achieved. However, the proteins could be purified only in small amounts
applying high detergent concentrations, and with unpredictable yields. The
GST-fusion protein of the alpha7-subunit was isolated from bacteria at a
concentration of 30 µg/ml and a total yield of 45 µg. As a third method, cell-
free expression was tested using two in vitro-systems from the companies Roche
and RiNA for the different intracellular loops. Only the intracellular delta-
loop was once successfully expressed in a small amount and enriched by
Ni2+-affinity chromatography. The expression in cell-free systems, in
particular regarding unusual proteins, can therefore be considered to
complement other expression methods. To obtain amounts of the nAChR
intracellular loop, sufficient for solving its structure, the procedures here
will have to be developed further.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
expression system
dc.subject
acetylcholine receptor
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Heterologe Expression einer funktionellen Domäne des nikotinischen
Acetylcholinrezeptors
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Ferdinand Hucho
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Werner Reutter
dc.date.accepted
2002-09-12
dc.date.embargoEnd
2002-10-02
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002002032
dc.title.translated
Heterologous expression of a functional domain of the nicotinic acetylcholine
receptor
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000572
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/203/
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open access