dc.contributor.author
Scholz, Patrick
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:04:46Z
dc.date.available
2009-06-02T08:09:19.025Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10013
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14211
dc.description.abstract
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus haben die Fähigkeit sich in
Zellkultur nahezu unbegrenzt zu vermehren und sich unter geeigneten
Kultivierungsbedingungen in die Zelltypen aller drei Keimblätter Mesoderm,
Endoderm und Ektoderm zu entwickeln. Für die erfolgreiche in-vitro-
Kultivierung von ES-Zellen ist es wichtig, die Umgebungsbedingungen der Zellen
so weit wie möglich den in-vivo-Bedingungen dieses Zelltyps anzupassen. Dies
gilt insbesondere für die Versorgung der Zellen mit einem geeigneten Medium
und den entsprechenden Zusätzen. Als ein solcher Zusatz wird fötales
Kälberserum (FBS) eingesetzt, das aus einer Vielzahl unterschiedlicher
Komponenten besteht, die für das Wachstum und die Differenzierung der ES-
Zellen essentiell sind. Da es sich hierbei um ein undefiniertes Naturprodukt
mit hoher Chargenvariabilität handelt, dessen Gewinnung ethisch bedenklich
ist, wird versucht ES-Zellen ohne den Zusatz von FBS zu kultivieren. Bisher
ist es kaum gelungen, undifferenzierte embryonale Stammzellen der Maus
effizient unter serumfreien Kulturbedingungen in schlagende Kardiomyozyten zu
differenzieren. In der vorliegenden Arb eit wurde die Differenzierung von
embryonalen Stammzellen der Maus unter serumreduzierten Kulturbedingungen
charakterisiert und ein zuvor etabliertes Gemisch von Supplementen auf seine
Eignung als Serumersatz beurteilt. Dazu wurden zunä chst Endpunkte für die
Untersuchung der in-vitro-Differenzierung von ES-Zellen zu Kardiomyozyten
etabliert und auf die Praktikabilität und Redundanz ihres Informationsgehaltes
überprüft. Dafür wurden die embryonalen Stammzellen über einen Zeitraum von
zehn Tagen unter Standardkulturbedingungen (15 % FBS) kultiviert und an den
Differenzierungstagen 5 bis 10 mit verschiedenen Methoden auf ihren
Differenzierungsstatus untersucht. Neben der morphologischen Beurteilung der
Zellen auf spontane Kontraktionen wurde die Differenzierung durch Markierung
filamentärer Strukturen visualisiert und mittels Durchflusszytometrie und
Genexpressionsanlyse quantifiziert. Als herzmuskelzellspezifisches Target
diente hierzu Myosin heavy chain (MHC), welches sowohl mit der Immunzytochemie
und in der FACS-Analyse auf Proteinebene, als auch in der Real Time PCR auf
RNA Ebene nachzuweisen war. Im Gegensatz zur herkömmlichen mikroskopischen
Auswertung bieten diese Methoden die Möglichkeit die ES-Zelldifferenzierung zu
Kardiomyozyten zu einem früheren Zeitunkt zu erfassen, jedoch ließen sich
objektive sowie reproduzierbare Ergebnisse nur mit der RT-PCR erreichen. Die
Durchführung von an das Protokoll des Embryonalen Stammzelltest (EST)
anlehnenden Proliferations-und Differenzierungstests, sowie die Anwendung der
zuvor etablierten Messmethoden ermöglichte im zweiten Abschnitt die
Untersuchung des Einflusses von serumreduzierten Kulturbedingungen mit und
ohne Supplementierung eines Serumersatzes auf das Wachstums- und
Differenzierungspotential der Stammzellen. Es konnte gezeigt werden, dass bei
der serumreduzierten Kultivierung ohne Supplementierung mit einem Serumersatz
mit abnehmender Serumkonzentration ein Rückgang der Differenzierung zu
verzeichnen war. Diese Zellpopulationen zeigten Unterschiede in der
Immunzytochemie, wiesen eine verminderte Kontraktilität sowie eine geringere
Expression von MHC auf Protein- und RNA-Ebene auf. Darüber hinaus konnte
jedoch bei einer Serumkonzentration von 2,5 % FBS mittels FACS-Analyse und
Real Time PCR eine leichte Zunahme des Differenzierungsverhaltens der ES-
Zellen beobachtet werden. Die Supplementierung mit einem als Serumersatz
geltenden Gemisch aus Wachstumsfaktoren, Hormonen, Proteinen, Vitaminen,
Spurenelementen und Antioxidantien ermöglichte die Kultivierung und
Differenzierung von ES-Zellen zu Kardiomyozyten. Im Vergleich zum
Standardkulturmedium (15 % FBS) zeigte sich mit 2 Tagen Verzögerung in der
24-Loch Funktionsanalyse eine maximale Kontraktilität. Immunzytologisch und
durchflusszytometrisch konnten keine Unterschiede hinsichtlich der
Differenzierung beobachtet werden. Eine Induktion kardialer α-MHC RNA wurde
hingegen bei einem Restserumanteil von 0,5 % FBS detektiert. Relativiert zum
Standardkulturmedium zeigte sich in diesen Testansätzen eine bis zu 7-fach
höhere Expression. Schwächen hinsichtlich der Adhäsion und daraus
resultierende Zellverluste spiegelten sich in den niedrigen Werten des
Proliferationsverhaltens wieder. In dieser Studie erwies sich das Gemisch von
Supplementen als geeignete Alternative zur Verwendung von fötalem Kälberserum
für die Kultivierung von murinen embryonalen Stammzellen. Die Supplementierung
definierter Bestandteile lässt embryonale Stammzellen unter nahezu serumfreien
Kulturbedingungen zu Kardiomyozyten differenzieren. Eine daraus resultierende
Serumreduktion von 15 % FBS auf lediglich 0,5 % FBS im Zellkulturmedium führt
somit zu einer höheren Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit in
Testsystemen. Zu dem leistet dies einen wichtigen Beitrag zu einer besseren
Vereinbarkeit von Ethik und Wissenschaft.
de
dc.description.abstract
Murine embryonic stem cells (ES-cells) in cell culture are capable of
unlimited self-renewal. Provided with ideal culture conditions they develop
into meso-, endo- and ectodermal cell types. Therefore the culture conditions
should mimic the in-vivo environment of the specific cell type. This requires
an appropriate cell culture medium and adequate supplements. A commonly used
supplement is fetal bovine serum (FBS) which contains many different
ingredients that are essential for proliferation and differentiation. FBS is
an undefined natural product with high batch to batch variability. Great
ethical doubts exist concerning the method by which it is obtained. Therefore
it has been tried to keep ES-cells without the addition of FBS. Experiments
investigating differentiation of murine embryonic stem cells into
cardiomyocytes under serum free culture conditions in the absence of FBS have
shown little success. The differentiation of ES-cells under serum reduced
culture conditions, as well as the usage of an approved mixture of supplements
as a serum replacement, has been tested in the present study. Methods for the
evaluation of ES-cell derived cardiomyocytes have been established and their
practicalities and redundancy have been valued. The ES-cells were cultured for
10 days in standard culture conditions (15 % FBS) and their differentiation
status was reported on days 5 to 10 using various test methods. Aside from the
morphological evaluation of spontaneous contraction, differentiation was
visualised by immunocytological staining of filaments and quantified by using
flow cytometry and Real Time PCR analysis. Myosin heavy chain (MHC) served as
the cardiomyocyte specific target. The presence of its proteins was shown with
immunocytochemical staining and FACS-analysis and the presence of its RNA with
Real Time PCR. Unlike conventional light microscope examination these methods
allow the detection of earlier stages of ES-cell differentiation into
cardiomyocytes. Consistant and objective results, however, have only been
achieved with PCR. The procedure of proliferation and differentiation assays
based on the EST-protocol as well as the utilisation of the previously
established measuring methods, has enabled the examination of the influence of
serum reduced culture conditions with or without serum replacement on the
proliferation and differentiation in the 2nd part of the study. In the serum
reduced culturing without any supply of serum replacement, a decreased
differentiation with lower serum concentration could be noticed.
Immunocytochemically the cell population showed differences as well as reduced
contraction and lower expression of MHC. However a slight increase of
differentiation was found at serum concentrations of 2,5 % FBS. Supplementing
a serum replacement containining growth factors, hormones, proteins, vitamins,
trace elements and antioxidants allowed the culturing of ES-cells and enabled
their differentiation into cardiomyocytes. Although the maximum of contraction
was delayed for 2 days, no differences could be detected in the
differentiation, compared to the standard culture medium (15 % FBS) using
immuncytochemistry and flow cytometry. An induction of cardiac α-MHC RNA was
seen at a serum concentration of 0,5 %. These sample preparations showed a 7
times increased expression in comparison to the standard culture medium. Low
proliferation rates reflect the degraded adhesion and resulting cell loss. In
this study the supplement mixture for culturing ES-cells proved to be an
adequate alternative to FBS. The addition of defined selected additives
enables the differentiation of ES-cells into ca rdiomyocytes in nearly serum
free culture conditions. The serum reduction from 15 % FBS to only 0,5 % FBS
leads to higher standardisation and reproducibility of the testing systems.
Furthermore it leads to a better compatibility of ethics and scientific
research.
en
dc.format.extent
X, 109 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
embryonic stem cells
dc.subject
serum-free (MeSH)
dc.subject
flow cytometry
dc.subject
polymerase chain reaction
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft
dc.title
Kultivierung embryonaler Stammzellen der Maus unter serumreduzierten
Kulturbedingungen mit und ohne Supplementierung eines Serumersatzes
dc.contributor.contact
redaktion@doktorverlag.de
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Johanna Plendl
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ralf Stahlmann
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Jörg Luy
dc.date.accepted
2009-04-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000010139-0
dc.title.translated
Cultivation of mouse embryonic stem cells under serum-reduced culture
conditions with and without a supplementation serum replacement
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000010139
refubium.note.author
VVB LAUFERSWEILER Verlag ; ISBN: 978-3-8359-5452-6
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006464
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access