Eignet sich ED-B Fibronektin als Zielmolekül für Athersoklerose in der Nah- Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung?

Abstract

Die derzeit verfügbaren Screening-Tests und diagnostischen Möglichkeiten sind unzureichend, um mögliche Opfer von Herzinfarkten vor dem Ereignis zu entdecken. Deswegen sollen, unabhängig von der Zahl oder Größe der atherosklerotischen Läsionen, spezifische biologische Aspekte der Atherosklerose in der Diagnostik der Koronargefäßerkrankung dargestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Matrixprotein ED-B Fibronektin ein mögliches Zielmolekül für die Atherosklerose-Diagnostik darstellt. Das Ziel dieser Arbeit war es zu testen, ob das ED-B Fibronektin im ApoE (-/-) Knockout(KO) Mausmodell in atherosklerotischen Läsionen mit Hilfe eines spezifischen single-chain Antikörpers gegen ED-B Fibronektin, der mit einem Nahinfrarot(NIRF)-Farbstoff gekoppelt wurde, in einem neuartigen NIRF- Imaging System nachgewiesen werden kann und sich somit prinzipiell als Zielmolekül für das molekulare Imaging der Atherosklerose eignet. Die Atherosklerosebildung der ApoE (-/-) KO Mäuse wurde mit Hilfe des Cholesterinabsorptionshemmers Ezetimib (EZE) beeinflusst. ApoE (-/-) KO Mäuse erhielten Fettfutter oder ein Fettfutter/EZE-Gemisch (0,005%) bis zum Alter von 4, 6 und 8 Monaten. NIRF-Messungen der aortalen Läsionen wurden 24 Stunden nach i.v. Applikation ex vivo durchgeführt. Die Plaquequantität und -qualität wurde mit histologischen und immunhistochemischen Methoden beurteilt. Das NIRF-Messsystem liefert stabile, reproduzierbare und miteinander vergleichbare Messdaten. Abhängig vom Alter und der Plaquemenge der ApoE (-/-) KO Mäuse wurde die Expression des ED-B Fibronektin in den atherosklerotischen Gefäßläsionen nachgewiesen. Ex vivo konnten zuverlässig intensive NIRF-Signale innerhalb der Plaques der Aorta und angrenzenden Gefäße gemessen werden. Die Ergebnisse der Plaqueflächenbestimmung durch die Sudan III-Färbung und die NIRF-Messungen korrelieren in hohem Maße (p<0,001). Die signifikante Reduktion der Plaqueflächen der sechs und acht Monate alten Tiere durch die EZE- Behandlung konnte mit Hilfe des ED-B Fibronektin-NIRF-Imagings nachvollzogen werden. Auch die histologischen Plaqueflächenanteile korrelieren in hohem Maße mit den immunhistochemisch nachgewiesenen ED-B Fibronektin und Mac-3 Flächenanteilen. Die EZE-Behandlung führt zu einer signifikanten Reduktion der ED-B Fibronektin und Mac-3 Immunoreaktivität in den Plaques der Arteria brachiocaphalica (p<0,05). Es ließ sich eine signifikante Reduktion der Plaquegröße bei den acht Monate alten, mit EZE therapierten ApoE (-/-) KO Mäusen, verglichen mit kürzer behandelten Tieren, messen (p<0,05), so dass eine regressive Wirkung des EZE angenommen werden kann. Die Ergebnisse der Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass es möglich ist, im ApoE (-/-) KO Mausmodell mit Hilfe eines NIRF-Farbstoff markierten neuartigen Antikörpers gegen ED-B Fibronektin atherosklerotische Läsionen, ex vivo hochspezifisch quantitativ und auch qualitativ zu bestimmen.

Available screening and diagnostic methods of coronary heart disease are insufficient to identify the victims of a lethal myocardial infarction before the event occurs. For this reason diagnostic methods have to be improved. Specific biologic aspects of atherosclerosis should be imaged independent of size and number of lesions. Extracellular matrix molecule ED-B fibronectin is a potential marker for atherosclerosis. The aim of the study was to determine if atherosclerotic lesions of ApoE(-/-) knock-out mice may be measured by an in vivo applied specific single chain antibody against ED-B fibronectin conjugated with a near-infrared fluorochrome in a near-infrared imaging system. Mice were analyzed at the age of four, six and eight months. Half of the mice were treated interventionally with Ezetimibe, a cholesterol absorption inhibitor. 24 hours after tail-vein injection of the antibody- conjugate mice were euthanized, the thoracal aorta was explanted and ex vivo measured. Afterwards Sudan III (red oil) staining was performed, which is the gold standard in microscopic quantification of atherosclerosis. Furthermore, atherosclerotic lesions quality and quantity were determined by histology and immunohistochemical stainings. NIRF-Measurement is a stable, reproducible and comparable method. ED-B fibronectin expression in mural atherosclerotic lesions was measured depending on the age and the plaque volume. Ex vivo intense NIRF signals within the plaques of the aorta and adjacent vessels could be measured. The results of the plaque area determination by the Sudan III staining and NIRF measurements correlate significantly (p <0001). The significant reduction caused by the EZE-treatment in the plaque area of the six and eight-month-old animals could be detected with the ED-B fibronectin- NIRF-imaging. Also, the histological plaque area correlated highly with the immunohistochemical areas of ED-B fibronectin and Mac-3 staining. The EZE- treatment lead to a significant reduction of ED-B fibronectin and Mac-3 immunoreactivity in the plaques in the artery brachiocephalica (p <0.05). There was a significant reduction in plaque size for the eight month old ApoE (-/-) knockout mice, treated with EZE, compared with shorter-treated animals (p <0.05), so that a regressive effect of EZE be can be assumed. The results of this work show the possibility to determine highly specific, both quantitatively and qualitatively atherosclerotic lesions ex vivo in the ApoE (-/-) knockout mouse model, using a NIRF dye-labeled novel antibody against ED-B fibronectin.