Funktionelle Validierung von Onkogenen bei molekularen Subtypen von diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen (DLBCL)

Abstract

Das diffuse großzellige B-Zell Lymphom (DLBCL) stellt mit einem Anteil von ca. 30-40% den häufigsten Lymphom-Subtyp bei Erwachsenen dar. Es ist eine heterogene diagnostische Kategorie, die anhand von Genexpressionsanalysen in zwei vorherrschende molekulare Subtypen unterteilt werden kann: Den Keimzentrums-B-Zell (GCB) Subtyp und den aktivierten B-Zell (ABC) Subtyp. Mehrere Studien konnten zeigen, dass diese molekularen Subtypen aus unterschiedlichen Vorläuferzellen während der B-Zell Entwicklung entstehen, von der Aktivierung bestimmter Signalwege abhängig sind und unterschiedliche klinische Verläufe aufweisen. Die Deregulation bestimmter Onkogene und Signalwege kann zur Entstehung der unterschiedlichen DLBCL-Subtypen beitragen. Allerdings sind viele der zugrunde liegenden molekularen und zellbiologischen Mechanismen immer noch unverstanden. Daher sollten in der vorliegenden Dissertation Subtyp-spezifische Onkogene bei den molekularen DLBCL-Subtypen identifiziert und ihre molekulare Funktion bei der Pathogenese von DLBCL untersucht werden. Bei primären DLBCL-Patienten konnte mittels Genexpressionsanalysen (n = 350; p = 2, 7 x 10-10) und Immunhistochemie (n = 249; p = 0, 001) gezeigt werden, dass ABC DLBCL eine signifikante Überexpression des anti-apoptotischen Proteins MCL1 aufweisen. Die Auswertung von array comparative genomic hybridisation (aCGH) Daten bei DLBCL-Patienten und -Zelllinien zeigte, dass die aberrante MCL1 Expression häufig auf chromosomale Amplifikationen zurückzuführen ist. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die konstitutive Aktivierung des JAK/STAT Signalweges zu einer MCL1 Deregulation bei DLBCL führt. Weitere funktionelle Analysen von MCL1 bei DLBCL-Zelllinien haben gezeigt, dass sowohl die Herunterregulation der MCL1 Expression mittels shRNA, als auch die Behandlung mit dem BH3-Mimetikum Obatoclax nur bei Zelllinien mit einer hohen MCL1 Expression toxisch ist und Apoptose auslöst. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass das Expressionslevel von MCL1 die Sensitivität von DLBCL-Zelllinien gegenüber diversen Chemotherapeutika beeinflusst. Des Weiteren konnte bei der Analyse von Genexpressionsdaten von 350 primären DLBCL-Patienten eine signifikante Überexpression von IκBζ, einem atypischen Mitglied der IκB-Familie, bei ABC DLBCL identifiziert werden (p = 5, 7 x 10-37). Die Herunterregulation von IκBζ mittels shRNA induzierte nur bei ABC DLBCL-Zelllinien und nicht bei GCB DLBCL- Zelllinien Zelltod. Überraschenderweise zeigten Genexpressionsanalysen, dass die Herunterregulation von IκBζ die Expression einer Vielzahl von typischen NF-κB-Zielgenen beeinflusst. Zudem konnte eine Interaktion zwischen IκBζ und den NF-κB-Untereinheiten p50 und p52 festgestellt werden, die auf eine regulatorische Funktion von IκBζ auf den klassischen und alternativen NF-κB- Signalweg deutet. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation die funktionelle Bedeutung von MCL1 und IκBζ bei der molekularen Pathogenese von DLBCL. Sowohl der Einfluss von MCL1 auf die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber diversen Chemotherapeutika als auch die Schlüsselposition von IκBζ bei der Regulation NF-κB-abhängiger Zielgene zeigen, dass eine spezifische Hemmung ihrer Aktivität einen therapeutischen Nutzen haben kann und sprechen für weitere Evaluationen in zukünftigen Studien.

Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) accounts for approximately 30-40% of all malignant lymphoma cases in adults. DLBCL is a heterogeneous diagnostic category and gene expression studies have identified two major molecular subgroups of DLBCL, termed germinal center B-cell-like (GCB) DLBCL and activated B-cell-like (ABC) DLBCL. Further studies revealed that these subgroups arise from different stages of normal B-cell differentiation, utilize distinct oncogenic mechanisms, and differ in their clinical behaviour. Deregulation of certain oncogenes and signaling pathways may contribute to the development of different DLBCL subtypes. However, many of the underlying molecular and biological mechanisms are not yet fully understood. Therefore, the aim of the present study was to identify novel subtype specific oncogenes and to elucidate their molecular function in the pathogenesis of DLBCL. Evaluation of gene expression profiling data from 350 DLBCL patient samples revealed the anti-apoptotic BCL2-Family member MCL1 to be upregulated in ABC compared to GCB DLBCL primary patient samples (p = 2.7 x 10-10). Immunohistochemistry confirmed high MCL1 protein expression predominantly in ABC DLBCL in an independent patient cohort (n = 249; p = 0.001). Analysis of array comparative genomic hybridisation (aCGH) data of DLBCL samples showed that aberrant expression of MCL1 is often caused by chromosomal amplifications. Additionally, constitutive STAT3 signaling was shown as a different mechanism leading to high MCL1 expression. Further analyses revealed that inhibition of MCL1 either by shRNA or treatment with the BH3-mimetic obatoclax induced apoptotic cell death only in MCL1 expressing DLBCL cell lines. Moreover, MCL1 expression levels affected sensitivity of DLBCL cell lines to chemotherapeutic agents commonly used in the treatment of DLBCL patients, indicating that MCL1 contributes to therapy resistance. In addition to these results, gene expression analyses showed that the atypical IκB-family member IκBζ is expressed in the ABC subtype of DLBCL at significant higher levels compared to GCB DLBCL patients (n = 350; p = 5.7 x 10-37). Knockdown of IκBζ using shRNA was toxic to ABC but not to GCB DLBCL cell lines. Gene expression profiling after IκBζ knockdown revealed a large number of known NF- κB target genes to be regulated by IκBζ. Further analyses detected a physical interaction of IκBζ with both p50 and p52 NF-κB subunits, indicating that IκBζ regulates a specific set of NF-κB target genes by interacting with components of the classical and alternative NF-κB pathway in ABC DLBCL. Collectively, the results of this study reveal the functional significance of IκBζ and MCL1 in the molecular pathogenesis of DLBCL. Both the effect of MCL1 on the sensitivity towards diverse chemotherapeutic agents as well as the key position of IκBζ in the regulation of NF-κB-dependent target genes suggest that their specific inhibition might be an effective therapeutic approach, and call for further evaluation in future studies.