Molekularbiologische Untersuchungen zur polymorphen Expression von Cytochrom P450 3A5 in der humanen Niere

Abstract

In der aktuellen Literatur wird CYP3A5 als ein interessantes neues Kandidatengen für die Blutdruckforschung angesehen. Sowohl Ergebnisse aus der tierexperimentellen Grundlagenforschung als auch klinisch-prospektive Assoziationsstudien der letzten Jahre gaben Grund zu der Annahme, die mischfunktionelle Oxidase CYP3A5 habe neben ihrer Rolle in der hepatischen Fremdstoffmetabolisierung eine physiologische Bedeutung für die Blutdruckregulation. Mit der Entdeckung eines funktionellen Polymorphismus im CYP3A5-Gen konnten starke interindividuelle Schwankungen der Proteinexpression von CYP3A5 erklärt werden. Untersuchungen an Lebergewebe zeigten, dass ein einzelner Basenaustausch im Intron 3 des CYP3A5-Gens (6986A>G) zu alternativem Spleißen der prä-mRNA führt. Die unmittelbare Folge für den Translationsprozess besteht in einer Verschiebung des Protein-Leserasters mit Kreation mehrerer vorzeitiger Stoppkodons und damit einem Abbruch der Proteinsynthese. Daher zeigen Träger von mindestens einem Wildtyp-Allel (A-Allel, CYP3A5*1) eine deutliche Proteinexpression, während bei homozygotem Vorliegen des mutierten Allels (G-Allel, CYP3A5*3) nur sehr geringe Mengen funktionellen Proteins gebildet werden. Da CYP3A5 als einziges CYP3A-Isoenzym eine deutliche Expression in der humanen Niere zeigt, erscheint ein Einfluss des Polymorphismus auf die Blutdruckregulation plausibel. Entsprechende Untersuchungen an Studienpopulationen unterschiedlichen ethnischen Hintergrunds führten jedoch bislang zu widersprüchlichen Ergebnissen. Die vorliegende Arbeit sollte daher die Genotyp-Phänotyp-Assoziation von CYP3A5 in menschlichem Nierengewebe beschreiben und weitere Erkenntnisse zu einem möglichen Einfluss auf die renale Blutdruckregulation hinzufügen. Dazu wurden zunächst n=102 Nierenproben eines kaukasischen Kollektivs hinsichtlich des 6986A>G-SNP im CYP3A5-Gen genotypisiert und anschließend der Gehalt an korrekt gespleißter CYP3A5-mRNA für jedes Individuum mittels Realtime-PCR quantifiziert. Es konnte eine klare Abhängigkeit der Expressionshöhe vom Vorhandensein eines oder zweier funktioneller CYP3A5*1-Allele festgestellt werden. Eine Beeinflussung der Genotyp-Phänotyp-Assoziation durch das strukturell sehr ähnliche und zumindest in der Leber quantitativ deutlich überlegene CYP3A4 oder durch weitere mit dem 6986A>G-SNP gekoppelte Polymorphismen in demselben Haplotypenblock um das CYP3A5-Gen konnte dabei nahezu ausgeschlossen werden. Hinsichtlich einer potentiellen Wirkung von CYP3A5 auf die Blutdruckregulation wurde eine Assoziation des CYP3A5*1-Allels mit der Transkription zweier Schlüsselproteine der Aktivierung des Mineralokortikoidrezeptors, ENaCα und SGK1, untersucht. Hierbei konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen CYP3A5*1-Allelstatus und der Expressionshöhe der ENaCα- und SGK1-mRNA gefunden werden. Gemäß einer weiteren aktuellen Hypothese findet eine Gen-Gen-Interaktion zwischen CYP3A5 und dem für den MDR1-Effluxtransporter kodierenden Gen ABCB1 mit Auswirkungen auf die Blutdruckhöhe beim Menschen statt. Nach Haplotypanalyse unserer Studienpopulation zeigte sich jedoch kein signifikanter Einfluss eines ABCB1-Haplotyps auf die Höhe der quantifizierten CYP3A5-mRNA. Die Lokalisierung des CYP3A5-Proteins in der humanen Niere erfolgte mittels Immunhistochemie anhand von Kryo- und Paraffinschnitten renaler Gewebsproben mit Hilfe eines polyklonalen CYP3A5-Antikörpers. Die Spezifität des verwendeten Antikörpers wurde mittels Western blot nachgewiesen. Während eine basale CYP3A5-Expression in allen epithelialen Strukturen der Niere nachweisbar war, zeigten sich quantitative Unterschiede in Abhängigkeit vom CYP3A5*1-Allelstatus ausschließlich im proximalen Tubulus. Diese Arbeit zeigt erstmals an einem relativ großen kaukasischen Kollektiv humaner Nierenproben, dass die mRNA-Expression von CYP3A5 analog zu Untersuchungen an Lebergewebe abhängig vom vorliegenden CYP3A5-Genotyp ist. Aktuelle Thesen bezüglich einer potentiellen Wirkung von CYP3A5 auf die Blutdruckregulation konnten zwar weder eindeutig bestätigt noch abgelehnt werden, allerdings könnten die in dieser Arbeit nachgewiesene Lokalisation der renalen CYP3A5-Proteinexpression sowie die Allel-spezifischen Expressionsunterschiede im proximalen Tubulus einen weiteren wichtigen Beitrag zu dessen möglicher Aufklärung leisten.

Based on the data of experimental research and prospective clinical trials, CYP3A5 has been linked to human blood pressure regulation. Inter-individual variability in the drug-metabolizing activity of the enzyme is mainly due to a single nucleotide polymorphism (SNP) in the CYP3A5 gene (6986A>G). The molecular consequences of the genetic aberration have been studied mainly in liver tissue revealing that the mutated CYP3A5*3 allele leads to an alternative splicing process followed by translational frameshift with creation of premature stop codons. Thus, carriers of at least one wildtype allele (CYP3A5*1) produce significant amount of functional CYP3A5 protein while individuals homozygous for the mutated CYP3A5*3 allele express very low amounts. As CYP3A5 is the main CYP3A isoenzyme in the human kidney, an effect of the CYP3A5 polymorphism on blood pressure regulation appears plausible, although controversial results regarding this association have been obtained. Therefore, we intended to perform a detailed genotype-phenotype analysis on CYP3A5 mRNA and protein expression in human renal tissue. In detail, we genotyped human kidney samples of n=102 Caucasian individuals followed by the quantitation of correctly spliced CYP3A5 mRNA for each individual through Real-time quantititative PCR. The mRNA level was clearly depending on the existance of one or two functional CYP3A5*1 alleles. Significant expression of CYP3A4, which is the main CYP3A isoenzyme in human liver, could be excluded. Haplotype analyses of the CYP3A5 locus revealed no relevant influence of other SNPs in linkage disequilibrium with the 6986A>G SNP. CYP3A5 has been hypothesised to alter mineralocorticoid receptor activity. We therefore performed expression analyses of the main two target proteins, EnaCα and SGK1, of mineralocorticoid receptor activation. No significant influence of CYP3A5 allele status on their mRNA expression levels was observed. Another recent hypothesis stated a gene-gene-interaction between CYP3A5 and ABCB1, which codes for the efflux transporter MDR1, also known as P-glycoprotein. However, haplotype analysis from our study cohort showed no significant interaction of ABCB1 haplotype with CYP3A5 mRNA expression levels. Regarding CYP3A5 protein expression, we performed immunohistochemistry using a specific CYP3A5 antibody on both paraffine and cryosections of renal tissue. Specificity of the monoclonal antibody was confirmed through Western blot analyses. Although all renal epithelia showed staining for CYP3A5 protein, differential expression depending on the CYP3A5*1 allele status was exclusively observed in epithelial cells of the proximal tubule. This is the first study showing the strong genotype - phenotype correlation between CYP3A5 genotype and its renal mRNA expression levels on a large set of normal human kidney samples from Caucasian individuals. Recent hypotheses regarding the influence of CYP3A5 on blood pressure regulation could neither be supported nor rejected. Nevertheless, especially our data regarding CYP3A5 protein localization in the human nephron and allele specific differential expression could add valuable information to their further elucidation.