Post harvest-Einsatz virulenter Bakteriophagen gegen Campylobacter spp. und Yersinia enterocolitica

Abstract

Ziel der Arbeit war es festzustellen, ob sich die Campylobacter-Bakteriophagen CP 81 und CP 84 sowie der Yersinia-Bakteriophage PY 100 für einen post harvest-Einsatz zur Senkung der Campylobacter und Yersinia enterocolitica- Belastung im Lebensmittel eignen. Bei den Untersuchungen der über die Bakteriophagen erzielten Keimzahlsenkung bei 37°C und 4°C in Medium sowie bei 4°C in Fleisch, konnte festgestellt werden, dass die Campylobacter- Bakteriophagen die Keimzahl ihres Wirtes bei 37°C in Medium nur um 1 log-Stufe senkten. Da beide Campylobacter-Bakteriophagen die Campylobacter-Keimzahl bei 4°C in Medium und in Fleisch nicht senken konnten, eignen sich diese Bakteriophagen nicht für einen post harvest-Einsatz. Der Yersinia- Bakteriophage PY 100 senkte die Keimzahl seines Wirtsbakteriums allerdings um bis zu 5 log-Stufen bei 37°C in Medium, um bis zu 3 log- Stufen bei 4°C in Medium und um 1,5 log-Stufen bei 4°C in Fleisch. Somit ist dieser Bakteriophage für einen post harvest-Einsatz geeignet. Da alle drei mit dem jeweiligen Bakteriophagen inkubierten Stämme nach einer Inkubation von 48 h bei 37°C eine Resistenz gegen den jeweiligen Bakteriophagen ausbildeten, wurden die hier erfolgten Resistenzmechanismen näher analysiert. Ein Binding- Assay zeigte, dass alle drei Bakteriophagen nicht mehr an die jeweiligen resistenten Klone binden konnten. Dies deutet darauf hin, dass die Phagen- Resistenz der Klone über eine Veränderung bzw. den Verlust des Bakteriophagen- Rezeptors entstanden sein könnte. Es konnten weiterhin keine Unterschiede im fAFLP-Bandenmuster, der flaA-Sequenz oder der CRISPR-Locus-Sequenz zwischen den Phagen-sensiblen und Phagen-resistenten Campylobacter-Klonen festgestellt werden. Dabei unterscheiden sich die erfolgten Resistenzmechanismen der Klone der drei Stämme untereinander, da die Phagen-resistenten C. jejuni NCTC 11168-Klone bei einer Subkultivierung ohne weiteren Phagen-Kontakt im Gegensatz zu den Phagen-resistenten C. coli NCTC 12668- und Y. enterocolitica 83/88/2-Klonen über den gesamten Zeitraum von sechs Wochen resistent blieben. Außerdem wiesen nur die Phagen-resistenten C. jejuni NCTC 11168-Klone eine zu den Phagen-sensiblen veränderte Beweglichkeit sowie eine über die Resistenz gegen den Bakteriophagen CP 81 erfolgte Kreuzresistenz gegenüber allen weiteren getesteten vier Gruppe III-Bakteriophagen auf. Die in der Literatur bei Phagen-resistenten C. jejuni NCTC 11168-Klonen beschriebenen Veränderungen der Poly G-Trakte der Gene cj1421 und cj1422 zeigten sich nur vereinzelt bei gegen CP 81 resistenten C. jejuni NCTC 11168-Klonen. Daher scheint diese Veränderung nicht den hauptsächlichen Resistenzmechanismus darzustellen.

The aim of this study was to determine if Campylobacter bacteriophages CP 81 und CP 84 as well as Yersinia bacteriophage PY 100 serve for post harvest application to reduce Campylobacter and Yersinia enterocolitica load in food. Therefore, it was assessed how these bacteriophages could decrease cell number of the corresponding host bacterium at 37°C and 4°C as well as at 4°C in meat. It was shown that the Campylobacter bacteriophages could only decrease cell number of its host at 37°C in medium by 1 log, independently of applied MOI. As both Campylobacter bacteriophages could not decrease Campylobacter numbers at 4°C in medium and in meat, these bacteriophages do not serve for post harvest application. In contrast, Yersinia bacteriophage PY 100 decreased cell numbers of its host successfully by up to 5 log at 37°C in medium, by up to 3 log at 4°C in medium and by 1.5 log at 4°C in meat. Therefore, this bacteriophage is suitable for post harvest application. All three strains developed resistance towards the corresponding bacteriophage when incubated with this phage for 48 h at 37°C. Therefore, resistance mechanisms were analysed into further detail. A binding assay revealed that all three bacteriophages could no longer bind to the corresponding resistant clones. This indicates a change or possible loss of the bacteriophage receptor. Between phage resistant and phage sensitive Campylobacter clones no changes of the fAFLP band patterns, flaA-sequence or the CRISPR locus could be observed. Resistance mechanisms of all three strains differ in the facts that phage resistant C. jejuni NCTC 11168 clones remained resistant over the whole testing period of six week of subculturing whereas phage resistant C. coli NCTC 12668 and Y. enterocolitica 83/88/2 clones turned back to phage sensitivity. Additionally, only phage resistant C. jejuni NCTC 11168 clones showed changed motility rates as well as cross resistance towards further bacteriophages of the same group. Changes of the poly G tract of genes cj1421 and cj1422 described in literature could only be detected in some of the phage resistant C. jejuni NCTC 11168 clones. This difference can therefore not represent the main resistance mechanism.