Die Rolle von KV-Kanälen und PI3K-Kinase bei der Regulation des arteriellen Blutgefäßtonus von Mäusen

Abstract

Der antikontraktile Effekt des perivaskulären Fettgewebes (PVAT) ist ein wichtiger Mechanismus der Regulation des Gefäßtonus in den peripheren Arterien. Die Ergebnisse früherer Studien zeigen, dass XE991-sensitive spannungsabhängige (KV) KV7-Kaliumkanäle (KCNQ), mit möglicher Beteiligung von KV7.1 und KV1.5-Kanälen, eine wichtige Rolle bei der Regulation des arteriellen Tonus durch PVAT spielen. Der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg ist an der Regulation von verschiedenen zellulären Prozessen involviert. Jedoch sind gegenwärtig die PVAT-regulierten KV-Kanal-Zielstrukturen, deren pharmakologische Eigenschaften in situ und die Rolle der PI3K-Isoformen (alpha, beta, gamma, delta) bei der Regulation des Gefäßtonus noch nicht ausreichend bekannt. Es wurden insgesamt drei genetisch veränderte Mauslinien (Kcnq1-/-; Kcna5-/-; Pik3cg-/-/Pik3cd-/-) und pharmakologische Hilfsmittel in myographischen Untersuchungen an isolierten Mesenterialarterien eingesetzt, um diese Fragen abzuklären. Der vermeintliche KV7.1-Öffner R-L3 verursachte eine Dosis-abhängige Relaxation (EC50~1.4 μM) in Wildtyp (Kcnq1+/+) und Kcnq1-/- mesenterialarteriellen Gefäßringen, die sowohl mit Phenylephrin (PE) als auch mit 60mM KCl vorkontrahiert worden waren. Diese Relaxation wurde weder durch 10μM Chromanol 293B (KV7.1-Blocker), 10μM HMR1556 (KV7.1-Blocker) noch 30μM XE991 (pan-KV7-Hemmer) beeinflusst. Der antikontraktile Effekt von PVAT war unverändert in Kcnq1-/- Mesenterialarterien. Chromanol 293B und HMR1556 beeinflussten den antikontraktilen Effekt von PVAT nicht. Isolierte Gefäßmuskelzellen (VSMC) von Kcnq1-/- und Kcna5-/- aus Mesenterialarterien zeigten normale KV-Ströme. Der KV7.2-5-Kanalöffner Retigabin induzierte eine Relaxation von Kcnq1-/- Gefäßen. Eine Inkubation der Gefäße mit 30µM XE991 reduzierte den antikontraktilen Effekt von PVAT nach PE-Applikation. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Inkubation von Gefäßen mit 0.3µM XE991 beobachtet. Diese Dosis ist dafür bekannt den KV-Kanal-Strom in VSMC nahezu komplett zu hemmen. XE991 hatte keinen Einfluss auf den BKCa-Kanal-Strom in VSMC. Sowohl in den Kcna5-/- als auch in den Wildtyp-Arterien, die zuvor mit 1µM DPO-1 (KV1.5-Blocker) inkubiert worden waren, zeigte sich eine normale PE-induzierte Vasokontraktion. Dieses traf sowohl auf Gefäße mit als auch ohne PVAT zu. Die Inkubation von Gefäßringen sowohl mit Wortmannin (100nM) als auch mit LY294002 (10µM) reduzierte PE-induzierte Gefäßkontraktionen. Diese Vasokontraktion wurde auch durch PI3Kalpha Hemmstoffe, wie A66 (10µM) und PI-103 (1µM), reduziert. Im Gegensatz dazu zeigten der PI3Kbeta Hemmstoff TGX 221 (100nM) und Pik3cg-/-/Pik3cd-/--Arterien eine normale Kontraktilität. Es kann gefolgert werden, dass PI3Kalpha in G-Protein-gekoppelte-Rezeptor (GPCR)- Signalwege integriert ist, die zumindest die Kontraktilität von Mesenterialarterien über adrenerge Alpha1-Rezeptoren mitreguliert. Die XE991-Downstream Effekte bei der PVAT Gefäßregulation laufen unabhängig von vaskulären BKCa-Kanälen ab. KV7.1 und KV1.5-Kanäle spielen keine Rolle bei der Gefäßtonusregulation von Mesenterialarterien der Maus durch adrenerge Alpha1-Rezeptoren und PVAT. R-L3 ist ein potenter Vasodilator, der Mesenterialarterien der Maus unabhängig von nativen vaskulären KV7.1-Kanälen relaxiert.

The anti-contractile effect of perivascular adipose tissue (PVAT) is an important mechanism in the modulation of vascular tone in peripheral arteries. Recent evidence has implicated a possible role of XE991-sensitive voltage- gated KV (KCNQ) channels in this process, with KV7.1 and KV1.5 channels representing likely candidates. PI3K-AKT-mTOR pathway is involved in regulation of numerous important cellular processes, including cell growth, differentiation, and metabolism. However, the nature and in vivo pharmacology of K+ channels contributing to PVAT-mediated relaxation, and the role of PI3Kalpha and other class I isoforms, i.e. PI3Kbeta, gamma, delta, in the regulation of vascular tone are largely unknown. Kcnq1-/-, Kcna5-/-, Pik3cg-/-/Pik3cd-/- deficient mice, pharmacological tools and myography on mesenteric arterial rings were used to determine the role of KV7.1, KV1.5 and PI3K in the regulation of arterial vascular tone. The putative KV7.1 opener R-L3 produced similar concentration-dependent relaxations (EC50~1.4 μM) of wild-type (Kcnq1+/+) and Kcnq1-/- mesenteric arteries pre-contracted with either phenylephrine (PE) or 60mM KCl. This relaxation was not affected by 10μM chromanol 293B (KV7.1-blocker), 10μM HMR1556 (KV7.1-blocker) or 30μM XE991 (pan-KV7-blocker). The anti-contractile effects of PVAT were normal in Kcnq1-/- arteries. Chromanol 293B and HMR1556 did not affect the anti- contractile effects of PVAT. Isolated VSMCs from Kcnq1-/- and Kcna5-/- mesenteric arteries exhibited normal peak KV currents. The KV7.2-5 opener retigabine caused similar relaxations in Kcnq1-/- and wild-type vessels. XE991 at 30μM reduced the anti-contractile response of PVAT. Similar effects were observed for XE991 at 0.3μM, which is known to almost completely inhibit mesenteric artery VSMC KV currents. 30μM XE991 did not affect VSMC BKCa channel currents. Kcna5-/- arteries and wild-type mesenteric arteries incubated with 1μM DPO-1 (KV1.5-blocker) showed normal vasocontractions in response to PE in the presence and absence of PVAT. PE-dependent contractions were inhibited by the pan PI3K inhibitors wortmannin (100nM) and LY294002 (10µM). These vasoconstrictions were also inhibited by the PI3Kalpha isoform inhibitors A66 (10µM) and PI-103 (1µM), but not by the PI3Kbeta isoform inhibitor TGX 221 (100nM). Pik3cg-/-/Pik3cd-/--arteries showed normal vasocontractions. It is concluded that PI3Kalpha is an important downstream element in vasoconstrictor G protein-coupled receptor (GPCR) signaling, which contributes to arterial vasocontraction at least via alpha1-adrenergic receptors. BKCa-channels are not downstream mediators of the XE991 effects in PVAT vasoregulation. KV7.1 and KV1.5-channels play no role in the control of arterial tone by alpha1-adrenergic vasoconstrictors and PVAT. In addition, R-L3 is a potent vasodilator in mouse mesenteric arteries, which dilates independently on native vascular KV7.1-channels.