Einige hämorrhagische Fieberviren, wie beispielsweise das Lassa Virus, CCHFV oder das Ebola und Marburg Virus sind hochkontagiös und gehen mit einer hohen Letalitätsrate einher, weshalb sie von besonderer Bedeutung für das klinische Management und den Bevölkerungsschutz sind. In Deutschland haben diese, vornehmlich in den Tropen und Subtropen verbreiteten, Infektionen vor allem aufgrund des zunehmenden Tourismus an Bedeutung gewonnen, durch den es in den letzten Jahren vereinzelt zum Import nach Deutschland kam. Durch ihre relativ unspezifische Anfangssymptomatik ist eine Abgrenzung zu anderen Infektionskrankheiten, wie beispielsweise Malaria oder einer Infektion mit einem nicht isolierbedürftigen hämorrhagischen Fiebervirus anhand des klinischen Bildes häufig schwierig. Um daher im Verdachtsfall angemessen reagieren zu können, werden große Ansprüche an die laborgestützte Diagnostik gestellt. So muss zum einen innerhalb kürzester Zeit eine große Anzahl wichtiger Differentialdiagnosen abgeklärt werden. Zum anderen muss eine zuverlässige virologische Diagnostik unter Hochsicherheitsbedingungen erfolgen, auf deren Basis eine begründete Verdachtsdiagose gestellt bzw. eine Infektion ausgeschlossen werden kann. Dem entsprechend wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Screeningverfahren für hämorrhagische Fieberviren entwickelt, welches die konventionelle Polymerase-Ketten-Reaktion mit der Pyrosequenzierung kombiniert, um die Nukleinsäuren der einzelnen Erreger schnell, sensitiv und spezifisch zu detektieren und diese in der anschließenden Sequenzierung zu typisieren. Da es sich um ein nukleinsäurebasiertes Nachweisverfahren handelt, eignet es sich vor allem in der frühen Phase einer Infektion als Diagnostikmethode. Es ist universell auf eine Vielzahl differentialdiagnostisch wichtiger Erreger sowohl viraler als auch bakterieller und parasitärer Genese anwendbar, die durch die Vereinheitlichung der Temperaturprofile sowie der Kombination einzelner PCR- bzw. PSQ-Assays parallel getestet werden können. Über die Etablierung interner Kontrollen sowie die Konstruktion spezieller Kontrollplasmide wurde bekannten Problemen in der PCR-Diagnostik begegnet und die Zuverlässigkeit des entwickelten Verfahrens weiter erhöht. Insgesamt bietet somit das entwickelte Screeningverfahren den Ansatz einer sensitiven, spezifischen und auch zuverlässigen labordiagnostischen Abklärung verschiedener hämorrhagischer Fieberviren sowie wichtiger Differentialdiagnosen mit nur einem Verfahren, wodurch vor allem Zeit, Kosten, Reagenzien und auch Probenmaterial gespart werden können.
Certain hemorrhagic fever viruses, as for example the Lassa virus, Crimean- Congo-HF-virus and Ebola and Marburg virus, are highly contagious and are associated with a very high rate of mortality; thus these viral infections have a great impact on both the clinical management of patients, as well as the protection of public health. Originating largely from tropical or subtropical regions, these viral fevers have grown in importance in Germany due to the increase in tourism abroad, and have in several cases been imported into the country. Because the infections share relatively unspecific initial symptoms, it is quite difficult to differentiate them from other infectious diseases according to their clinical symptoms, such as malaria or infections caused by non-transmissible between humans hemorrhagic fever viruses. Hence, to be able to react appropriately in case of a suspicious case, great demands are put into the laboratory diagnosis: On one hand, a large number of differential diagnoses have to be ruled out in a short space of time; on the other, a reliable virological diagnosis has to be performed under conditions of high biosafety level, on the basis of which a reasonable final diagnosis can be established. Accordingly, this study has come up with a method of screening for hemorrhagic fever viruses, which combines the conventional technique of polymerase chain reaction with pyrosequencing, with the aim of being able to quickly, sensitively and specifically detect the nucleic acids of individual viral agents, and to subsequently typify them during the following DNA-sequencing. Since this procedure of verification is based on viral nucleic acids, it is particularly useful as a diagnostic tool in the early stages of infection. The procedure is universally applicable for a multitude of diagnostically significant infectious agents both of viral and bacterial, as well as parasitic origin, which can be tested at the same time through the standardisation of temperature profiles, as well as the combination of different PCR- and PSQ assays. Through the establishment of internal controls and the construction of special control plasmids, known problems of PCR-based diagnosis were counteracted and the reliability of the developed technique further increased. Overall, the newly developed screening- method offers a sensitive, specific and reliable approach to the clarification of various hemorrhagic fever viruses in the laboratory, as well as differential diagnoses in only one procedure, thus conserving time, reagents, funds and testing materials.
