Identifizierung von Spleißvarianten mit prognostischer Relevanz im Kolonkarzinom

Abstract

Alternatives Spleißen ist ein an der Entstehung der Proteindiversität beteiligter Mechanismus und kann auch eine wichtige Rolle während Karzinogenese und Tumorprogression spielen. Ein besonders wichtiger Signaltransduktionsweg für die Entwicklung, Invasion und Metastasierung unterschiedlicher Tumorarten ist der Wnt-Pathway. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war die Suche nach tumorrelevanten Spleißformen von in Kolonkarzinom exprimierten Genen des Wnt/beta-Catenin -Pathways. Die möglichen alternativen Spleißformen aus der Datenbank der Arbeitsgruppe Bioinformatik (MDC Berlin) sollten überprüft und deren tumorassozierte Expression anhand von Gewebeproben der 14 Patienten, jeweils krebsverändertes und dazugehörendes gesundes Gewebe bestimmt werden. Die Auswahl fiel auf sechs Gene, die folgenden zentralen Moleküle im Wnt-Pathway kodieren: CTNNB1 (beta-Catenin), CtBP1 (C-terminal Binding Protein), CK1A (Casein Kinase 1A), GSK3-beta (Glycogen-Synthase-Kinase 3-beta), LRP5 (Low density lipoprotein related protein 5) und Axin1 (Axin). Der Nachweis putativer Spleißtranskripte im humanen Kolongewebe erfolgte mit RT-PCR-Techniken. Bei allen Amplifikaten wurde die Sequenz im „SeqLab-Labor“ Göttingen bestimmt. Für Axin1 wurde zur RT-PCR zusätzlich die quantitative Expressionsmessung beider Isoformen mit Hilfe von Real-Time PCR mittels TaqMan durchgeführt. Zusammenfassend sind beide Isoformen, konstitutive und alternative, bei sechs von acht untersuchten Spleißstellen der Wnt-Gene in allen Zelllinien, im Tumorgewebe und dazugehörenden nicht-neoplastischen Mucosa aus Patientenproben gefunden. Dabei wurden zwei neue Spleißtranskripte (CTNNB1 und LRP5) identifiziert. Die sequenzierten PCR-Produkte wiesen bei allen Genen eine komplette Übereinstimmung mit den bioinformatisch vorhergesagten Spleißvarianten auf. Die bioinformatische Vorarbeit ermöglichte somit zuverlässig die Identifizierung von Spleißvarianten im humanen Gewebe. Alle Spleißstellen, unter Ausnahme von CTNNB1, liegen in dem für das Protein codierenden pre-mRNA- Bereich und können somit zur veränderten Aminosäurensequenz führen. Daher können sie auch als biologische Marker fungieren. Besonders der Tumorsuppressor Axin1 könnte in seiner Expression umgekehrt proportional mit späten Tumorstadien und der Neigung zur Metastasenbildung korrelieren und zukünftig in Rahmen größerer Patienten-Stichproben als Prognose- und Verlaufsparameter interessant werden.

Alternative splicing is a mechanism for increasing protein diversity that might play a crucial role in carcinogenesis and tumor progression. The Wnt- pathway represents an important transduction cascade for development, invasion, and metastasis of different carcinomas. The motivation for this study was to search for splice variants which show a deregulated expression in colon cancer and which belong to the Wnt/beta-Catenin signalling pathway. The expression of differentially spliced variants predicted by bioinformatics (Database at MDC Berlin), was validated in tumor samples and corresponding normal tissue of 14 patients. We focused on six genes, which code for central key molecules of the wnt-pathway: CTNNB1 (beta-Catenin), CtBP1 (C-terminal Binding Protein), CK1A (Casein Kinase 1A), GSK3-beta (Glycogen-Synthase-Kinase 3-beta), LRP5 (Low density lipoprotein related protein 5), and Axin1. RT-PCR was used to examine expression levels of the putative transcripts in human colonic tissue. All amplicons obtained were sequenced. The expression of Axin 1 splice forms was analyzed by RT-PCR and quantitative real-time RT-PCR using TaqMan technology. In summary, both splice variants – normal and alternative ones occur in six out of eight selected splice events in wnt-components and were found to be expressed in cell lines as well as in samples derived from tumor and non-malignant mucosa from patients. Two hitherto undescribed alternative splice forms (CTNNB1 und LRP5) were detected. All splice positions fully corresponded with the bioinformatic prediction as shown by sequencing. This study demonstrates the potential of bioinformatic prediction for the search and identification of new splice sites in human tissues. With the exception of CTNNB1, all splice sites were located within the coding pre-mRNA and lead to changes in amino acid sequences. Consequently, they may have a potential to act as biological markers. Especially the tumor supressor Axin1 can be inversely correlated with late tumor stages and formation of distant metastasis. The described findings may become important as parameters of tumor prognosis and development in future studies with more patients.