Membrane Topology and Processing of the Minor Glycoproteins of Equine Arteritis Virus

Abstract

Equine arteritis virus (EAV) is an enveloped RNA virus from the family Arteriviridae, which causes equine viral arteritis, mainly associated with abortions in mares. The trimer composed of the minor envelope glycoproteins Gp2, Gp3 and Gp4 is required for cell entry. These glycoproteins are predicted to be type I membrane protein with cleavable signal peptide (SP). To determine membrane topology in cells, the localisation of YFP fused C-terminally to the glycoproteins was analysed. In contrast to Gp2b and Gp4, the fluorescent tag of Gp3 localised in the lumen of the ER suggesting that the signal peptide (SP) functions as an uncleaved signal anchor (type II topology). The analysis of the glycosylation of Gp3 revealed that an overlapping sequon NNTT, adjacent to the SP cleavage site, was modified at both asparagines, although not in every Gp3 molecule. The presence of at least one glycosylation site in this region prevented SP cleavage in Gp3. Deletion of the overlapping sequon and blocking the glycosylation allowed SP cleavage, indicating that carbohydrate attachment inhibits processing of a potentially cleavable SP. The same phenomenon was observed in recombinant viruses, but surprisingly the infectivity of the EAV lacking the SP was not impaired. Membrane fractionation of transfected cells revealed that the uncleaved SP of the Gp3 was not responsible for membrane attachment of the protein. The membrane anchoring was achieved by the hydrophobic C-terminus, as its deletion allowed secretion of the protein to the supernatant. As a result of my study I propose a new topology model of Gp3, where the uncleaved SP is completely translocated into the ER lumen. The protein is anchored in the membrane via its hydrophobic C-terminus, which however does not span the membrane completely. Additionally, in order to express the Gp2/4 heterodimer on the plasma membrane for functional studies on this complex, the transmembrane regions and cytoplasmic tails were exchanged with corresponding regions of haemagglutinin of Influenza A. The proteins were able to form disulphide-linked Gp2/4 heterodimers, but were not targeted to the cell surface. In addition, single cysteines in the ectodomain of Gp4 were mutated, to determine the responsible one for the covalent linkage to Gp2. These mutations in transiently expressed Gp2/4, did not abolish dimer formation, but led to non-infectious virions in the viral context. The presented data about the minor glycoproteins of the EAV may facilitate studies on the Arterivirus entry. The SP retention mechanism observed in Gp3 could also apply for the other mammalian proteins. Future studies are needed to reveal the molecular basis of the unusual translocation and double sequon glycosylation of the Gp3.

Das Equine Arteritisvirus (EAV) ist ein umhülltes RNA Virus aus der Familie der Arteriviridae, welches die equine virale Arteritis hervorruft, die mit Fehlgeburten in Stuten einhergeht. Der trimere Komplex, gebildet aus den Glykoproteinen Gp2, Gp3 und Gp4 ist für den Eintritt des Virus in die Zelle verantwortlich. Von diesen Glykoproteinen nimmt man an, dass sie Typ I-Membranproteine sind, die über ein spaltbares Signalpeptid (SP) verfügen. Um die Orientierung der Proteine in der Membran zu bestimmen, wurde die Lokalisierung eines YFPs, welches C-terminal mit den Glykoproteine fusioniert wurde, untersucht. Im Gegensatz zu Gp2 und Gp4, befindet sich der Fluorophor von Gp3 im Lumen des ERs, was darauf schließen lässt, dass das Signalpeptid als nicht gespaltener Signalanker fungiert (Typ II-Topologie). Die Untersuchung des Glykosylierungsstatus von Gp3 ergab, dass die überlappende Glykosylierungssequenz NNTT, welche sich neben der Spaltstelle des SPs befindet, an beiden Asparaginen modifiziert wird; jedoch nicht in jedem Gp3 Molekül. Das Vorkommen von mindestens einer Glykosylierung in dieser Region ist in der Lage die Signalpeptidspaltung zu verhindern. Die Deletion sowie das Blockieren der Glykosylierung ermöglichen jedoch die Signalpeptidspaltung, was darauf schließen lässt, dass das Anhängen der Zuckerketten die Prozessierung des potentiell spaltbaren SPs verhindert. Dieses Phänomen konnte auch in rekombinanten Viren gezeigt werden, jedoch hatte die Abspaltung des Signalpeptides überraschenderweise keinen Einfluss auf die Infektivität des Virus. Die Untersuchung der Membranbindung in transfizierten Zellen ergab, dass das ungespaltene SP nicht für die Membranbindung verantwortlich ist, sondern der hydrophobe C-Terminus, da seine Deletion die Sekretion des Proteins in den Überstand ermöglichte. Als Ergebnis meiner Untersuchungen stelle ich ein neues Modell für die Topologie von Gp3 auf, in dem das ungeschnittene Signalpeptid vollständig in das Lumen des ERs transloziert wird. Die Membranverankerung findet dabei durch die hydrophobe C-terminale Domäne statt, welche jedoch die Membran nicht komplett durchspannt. Zusätzlich wurden Konstrukte erstellt, in denen die Transmembrandomänen sowie der zytoplasmatische Teil von Gp2 und Gp4 durch die entsprechende Region vom Hämagglutinin der Influenzaviren ersetzt wurde. Diese waren in der Lage Gp2/4 Heterodimere zu bilden, wurde jedoch nicht an die Plasmamembran transportiert. Um das für die kovalente Bindung von Gp4 zu Gp2 verantwortliche Cystein zu identifizieren, wurden einzelne Cysteine in der Ektodomäne des Gp4s mutiert und in Zellen exprimiert. Keine der Mutationen was in der Lage die Dimerisierung zu verhindern, allerdings führten die Mutationen im viralen Kontext zu nicht infektiösen Viruspartikeln. Die präsentierten Daten über EAV könnten die Erforschung des Eintritts der Arteriviren erleichtern. Zudem könnte die Beibehaltung des Signalpeptids, wie es für Gp3 beobachtet wurde, auch für andere Säugerproteine zutreffen. Jedoch sind weitere Studien nötig, um den ungewöhnlichen Mechanismus der Translokation und der Nutzung der überlappenden Glykosylierungssequenz von Gp3 aufzuklären.