Transkriptionsregulation der Sekretoglobuline Mammaglobin 1 und Lipophilin B in mGPx4-überexprimierenden Mammakarzinom-Zellen

Abstract

Sekretoglobuline wie Mammaglobin 1 (MGB1) und Lipophilin B (LipB) sind kleine, selten glykosylierte Proteine, deren Expressionsmuster vorwiegend im sekretorischen Epithel von Säugetieren nachweisbar sind. Diese liegen als Homo- bzw. Heterodimere vor, deren genaue physiologische Bedeutung bis dato unbekannt ist. Allerdings scheinen einigen Vertretern der SCGBs eine funktionelle Bedeutung in der Genese diverser Tumore zuzukommen. Die Expression von LipB sowie MGB1 ist im humanen Mammakarzinom hochreguliert. Eine deutliche Hochregulation konnte in einer transgenen Brustkrebszelle (7G4) gezeigt werden, die die mGPx4, ein reduzierendes Enzym mit anti-apoptotischen Eigenschaften, überexprimiert. MGB1 ist ein relativ gut erforschter Tumormarker für Brustkrebs. Dagegen ist nur sehr wenig über die Expressionsregulation seines Dimerpartners LipB bekannt. Zu klärende Kernpunkte dieser Arbeit waren deshalb zum einen die Beleuchtung der transkriptionellen Aktivierung der LipB-Expression. Zum anderen die Diskussion der möglichen biologischen und mechanistischen Funktion der mGPx4, die mit einem veränderten Expressionsmuster im Brustkrebs assoziiert ist. Zur Klärung der erst genannten Problematik konnten initiale in silico-Analysen cis- aktivierende Elemente im proximalen LipB-Promotor identifizieren. Funktionelle Promotorstudien bestätigten innerhalb dieser Sequenz deutliche transkriptionelle Aktivitäten. Daran anschließende EMSA-Versuche zeigten spezifische DNA-Protein-Interaktion der Faktoren Sp1 sowie NF1. Jedoch konnten darin keine differentiellen Gelshifts nachgewiesen werden. Die Untersuchungen der potentiellen Beteiligung der mGPx4 in die Transkriptelongation und –stabilität ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen 7G4 und VC. Die Erforschung epigenetischer Mechanismen wie der CpGMethylierung und Histonacetylierung waren in ihrer Aussage uneinheitlich. 5-Aza-2’- desoxycytidin, ein Methyltransferase-Inhibitor, bewirkte eine generelle transkriptionelle Aktivierung. TSA und Butyrat dagegen reprimierte die MGB1/LipBExpression. Schließlich gaben real time-PCR-Analysen Hinweise auf den Zusammenhang von Proliferationsarrest und HDACI-induzierte p21WAF1/CIP1-Hochregulation.

Mammaglobin A (MGB1) and lipophilin B are (LipB) members of the secretoglobin superfamily, a group of small, secretory, rarely glycosylated, dimeric proteins with unclear physiologic functions, mainly expressed in mammalian secretory epithelia. It seems that the secretoglobin polypeptides could be of functional importance in the development of various human cancers. Moreover, the expression levels of mammaglobin A in breast tumors were up-regulated and significantly correlated with those of lipophilin B. An explicit up-regulation was shown in a gene-modified mamma carcinoma cell (7G4), which overexpressed the mitochondrial GPx4, a reductive and anti-apoptotic protein. Since Mammaglobin A is a well-known marker for breast tumor, there are some studies about his regulation and expression, but on the other hand it is still little known about the gene regulation of its dimeric partner Lipophilin B. The aims of the present study are on the one hand to investigate the transcriptional activation of the LipB gene expression in 7G4 and control cells (vector control). On the other hand the discussion about the possible biological and mechanistic relation of GPx4 associated with the changed expression pattern of secretoglobins in breast cancer. Initial in silico-analysis of the proximal LipB-up streamsequenz could identify cis-acting elements. Luciferase reporter assays confirm transcriptional activities in this promoter region. Following studies of end-labeled DIG probes in EMSAs demonstrated specific DNA-protein- interactions with the maximum likelihood, indicating the binding of Sp1 and NF1. However no differential shift binding was observed. The analysis of the involvement of the mitochondrial GPx4 in transcript stability and elongation revealed no significant differences. Elucidating epigenetic regulatory mechanisms (e.g. DNA Methylation and Histone Acetylation) addicted inconsistent conclusions. The use of 5-Aza-2’-desoxycytidine confirmed general transcriptional activity, whereas Trichostatin A and Butyrat could downregulate MGB1/LipB gene expression in mGPx4 transfectant and vector control. In addition, real time PCR analysis revealed the relation of cell growth arrest and the up regulation of p21WAF1/CIP1 due to TSA/Butyrat application.