Serumglykom-Charakterisierung und automatisierte Strukturaufklärung der N-Glykane beim Ovarialkarzinom

Abstract

Die N-Glykosylierung von Proteinen ist eine wichtige und häufig vorkommende, co-translationale Modifikation mit fundamental-biologischer Relevanz. Sie beeinflusst eine Vielzahl an Eigenschaften von Proteinen, so z. B. deren Stabilität, Sekretion, Protein-Protein Wechselwirkungen und ihre immunogene Aktivität. Veränderungen im Glykosylierungsmuster korrelieren häufig mit der Entstehung einer Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich Krebs. Gegenwärtig ist die Probenaufarbeitung für eine Hochdurchsatzanalyse von N-Glykanen nicht etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine robotergestützte Hochdurchsatzmethode im 96 well-Plattenformat entwickelt. Der Roboter ermöglicht die Behandlung von N Glykanen mit PNGase F, die Entfernung der Sialinsäuren und die Derivatisierung des GlcNAc am reduzierenden Ende mittels APTS. Es können Proteine in Lösung, isolierte Glykoproteine aus SDS PAGE Gelen oder komplettes Blutserum verwendet werden. Eine Kombination von MALDI-TOF-MS und Kapillarelektrophorese (CE) wurde zur Analyse der N Glykane erprobt. Erstmalig gelang die kapillarelektrophoretische Auftrennung und Identifikation der zwei triantennären Isomere mit der GlcNAc(beta1-4)Man(alpha1-3)Man und GlcNAc(beta1-6)Man(alpha1-6)Man Antenne. Der neuartige Prozess wurde für die Suche nach potenziellen Biomarkern für das Ovarialkarzinom angewandt. Zehn Glykoproteine, isoliert aus 2D-Gelen und N-Glykane aus Blutserum, wurden analysiert. Die N-Glykane wurden mit PNGAse F abgespalten und mittels MALDI- TOF-MS und CE untersucht. Das digalactosylierte biantennäre core-fucosylierte N-Glykan, die triantennäre Grundstruktur mit der GlcNAc(beta1-6)-Variante an der dritten Antenne, das tetragalactosylierte tetraantennäre N-Glykan mit einer antennären Fuc und das tetragalactosylierte tetraantennäre N-Glykan mit drei antennären Fuc wurden als potenzielle Biomarker identifiziert. Weiterhin wurde eine Eintopfreaktion für die Detektion von O-Glykosylierungsstellen etabliert. Ein Biotin-Thiol-Reagenz wurde mittels Festphasensynthese am Cysteamin synthetisiert. Glycin und PEG wurden zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit eingeführt. Zur Detektion der O-Glykosylierungsstellen wurden die O-Glykane des Modellproteins Fetuin (FETUA) durch beta-Eliminierung entfernt. Das entstandene Michael-System reagierte mit der Thiol-Gruppe des Biotin-Thiol-Reagenz. Über eine Avidin-Chromatographie und sich anschließende massenspektrometrische Untersuchungen konnten O-glykosylierte Peptide isoliert und identifiziert werden. Die Verwendung von zwei Biotin-R-SH Reagenzien mit unterschiedlicher Masse erleichterte die Identifikation O-glykosylierter Peptide.

N-glycosylation of proteins is an important and frequently occuring co- translational modification. Glycans affect a number of proteins properties including stability, secretion, protein-protein interactions and immunogenicity, and are therefore of fundamental biological relevance. Changes in the glycosylation pattern are often associated with the development of a variety of diseases such as cancer. So far limitations in sample preparation hamper high-throughput analysis of glycans. In this study, a robot-aided 96-well plate high-througput method has been developed. The robot allows the release of N-glycans using PNGase F, the removal of sialic acids and the derivatization of reducing GlcNAc using APTS. It can handle recombinant glycoproteins in solution, glycoproteins from SDS PAGE gels as well as serum. A combination of mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and capillary electrophoresis (CE) was used to analyze N-glycans. For the first time, separation and identification of the isomers of triantennary N-glycans, namely with GlcNAc(beta1-4)Man(alpha1-3)Man and GlcNAc(beta1-6)Man(alpha1-6)Man antennae were shown by CE. The novel process was used to search for potential ovarian cancer biomarkers. Ten glycoproteins were isolated from 2D-gels and analyzed as well as N-glycans from serum. N-glycans were cleaved using PNGase F and analyzed by MALDI-TOF-MS and CE. The core-fucosylated digalactosylated biantennary N-glycan, the triantennary N-glycan carrying a GlcNAc(beta1-6) on the third antenna, the tetragalactosylated tetraantennary N-glycan bearing one antennary fucose and the tetragalactosylated tetraantennary N-glycan bearing three antennary fucoses were identified as potential biomarkers. Furthermore, a one-pot reaction for the detection of O-glycosylation sites has been established. A biotin-thiol reagent was produced by solid phase synthesis using cysteamine. Glycine and PEG as groups conferring water solubility were introduced. For the detection of O-glycosylation sites O-glycans from the model protein fetuin were removed by beta-elimination. The resulting Michael- System reacts with the thiol group of the biotin-thiol reagent. O-glycosylated peptides were isolated and identified using avidin-chromatography and mass spectrometry. The use of two biotin-R-SH reagents with different masses improved the identification of O-glycosylated peptides.