Die Orientierung des elektronischen Übergangsdipolmoments in stationären und transienten Chromophorzuständen der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin: Gleichlicht- und zeitaufgelöste Absorptionsspektroskopie mit linear polarisiertem Licht an orientierten Purpurmembranen

Abstract

Orientierungsanderungen des Retinalchromophors, insbesondere durch Isomerisierung, spielen eine funktionell wichtige Rolle fur den lichtinduzierten Protonentransport beim Membranprotein Bacteriorhodopsin (bR). Als Indikator der Chromophororientierung dient die Orientierung des elektronischen Übergangsdipolmoments, die experimentell durch Absorptionsspektroskopie mit linear polarisiertem Licht zuganglich ist. Stationare und transiente Chromophorzustande von Bacteriorhodopsin wurden in orientierten Purpurmembransystemen untersucht.

Zur Orientierung der Purpurmembranen wurde, neben der etablierten Methode Membranen in starken Magnetfeldern auszurichten, ein alternatives Verfahren entwickelt, bei dem durch Trocknen und anisotropes Quellen von PAA-Gelen eine Ausrichtung der darin eingebetteten Membranen erreicht wird. Fur Gleichlicht- und zeitaufgeloste Absorptionsmessungen mit linear polarisiertem Licht wurde ein Meßverfahren eingefuhrt, das den Lineardichroismus und die lineare Doppelbrechung als unabhangige Meßgroßen liefert. Da die Chromophorbeitrage dieser Großen aber uber die Kramers-Kronig-Relationen verknupft sind, ergibt sich hieraus eine Kontrollmoglichkeit fur die Bestimmung der Chromophoranisotropie. Fur die zeitaufgelosten Messungen mit isotroper Anregung wurde ein modellunabhangiges Auswertungsverfahren entwickelt, das es erlaubt, aus Absorptionsanderung und transientem Lineardichroismus, unter Verwendung von geeigneten Nebenbedingungen, nicht nur die Orientierung des Übergangsdipolmoments bezuglich der Membrannormalen in transienten Intermediaten, sondern auch die Spektren und die zeitliche Konzentrationsverlaufe der Intermediate zu bestimmen.

Im Übergang von der all-trans Konformation zur 13-cis,15-syn Konformation, der bei der Licht-Dunkel-Adaptation ablauft, andert sich die Orientierung des elektronischen Übergangsdipolmoments im Rahmen der Meßgenauigkeit nicht. Die 9-cis Isomerisierung, die den photoinduzierten Übergang von der blauen Form in den Pinkzustand begleitet, ist dagegen mit einer Zunahme des Winkels zwischen dem Übergangsdipolmoment und der Membrannormalen um etwa 2.5° verbunden. In den transienten Intermediaten K, L, M und N bzw. im photostationaren M-Zustand liegt der Chromophor in einer 13-cis,15-anti Konformation vor, und der Winkel zwischen dem Übergangsdipolmoment und der Membrannormalen ist um 1° \- 4° kleiner als in der all-trans Konformation des bR-Grundzustands.

Orientational changes of the retinal-chromophore especially via isomerization pl ay an important role in the light-induced proton transport of the membrane protein bacteriorhodopsin (bR). The orientation of the transition dipole moment, which is experimentally accessi ble by absorption spectroscopy with linearly polarized light serves as an indicator of the chromophore orientation. Stationary and transient chromophore states of bacteriorhodopsin were investigat ed in oriented purple membrane samples.

The orientation of the purple membranes was achieved in high magnetic fields whi ch is a well-established method. An alternative method was developed in which the membranes are first immobilized in PAA gels and are aligned by drying and an isotropic swelling of the gels. In steady-state and time- resolved absorption measurements a procedure was introd uced, which provides linear dichroism and linear birefringence as independent paramete rs. Since the chromophore contributions of these parameters are connected via the Kramers-Kronig transform, this constitutes an additional control for the determi nation of the chromophore anisotropy. For the time-resolved measurements with isotropic excitation a novel model independent formalism was developed, which allows the determination from absorption changes and transient linear dichroism not only of the orientation of the transition dipole moment with respect to the membrane normal in transient intermediates, but also the intermediate spectra and time courses.

When the chromophore conformation changes from all-trans to 13-cis,15-syn during light-dark adaptation, the orientation of the electronic transition dipole moment is unchanged in the limit of experimental accuracy. The photoinduced transition from the blue state to the pink state is accompanied by 9-cis isomerization and an increase of the angle betwee n the transition dipole moment and the membrane normal of about 2.5°. In the transient intermediates K, L, M and N and in the photostationary M-state respectively the chromophor is in 13-cis,15-anti conformation and the angle bet ween the transition dipole moment and the membrane normal is 1° - 4° smaller than in the all-trans conformation of the bR-groundstate.