The World Health Organisation classifies the appearance of antibiotic resistance as one of the biggest threats to human health, thus emphasising the urgent need for new treatment options. This is particularly relevant for skin and soft tissue infections (SSTIs), which are mainly caused by the so called ESKAPE pathogens, which belong to the most recalcitrant bacteria and are resistant to almost all common antibiotics. Conventional antibiotics may kill bacteria, but can trigger the release of pathogenicity factors from the bacterial cell wall, which are the causative agents for sepsis. Synthetic anti-lipopolysaccharide peptides (SALPs) bind to and neutralise pathogenicity factors of Gram-negative and Gram-positive bacteria and therefore prevent lipopolysaccharide (LPS)- or lipopeptide-mediated hyperactivation of Toll-like receptor (TLR)4 and TLR2, respectively, and could protect from sepsis in vivo. However, TLR4 inhibitors failed in clinical trials for the treatment of severe sepsis, suggesting a TLR4-independent mechanism that is decisive for sepsis development. Notably, recognition of LPS in the cytosol by inflammatory caspases leading to pyroptosis and non-canonical inflammasome activation and thus capsase-1-dependent maturation of IL-1β and IL-18 emerged as essential trigger for the development of septic shock. The delivery of LPS to the cytosol was shown to be mediated via outer membrane vesicles (OMVs), which are secreted by Gram-negative bacteria during all growth phases and as an adaptive response to stress. Since SALPs can inhibit binding of LPS to TLR4, it could be assumed that they might also block immune responses provoked by intracellular LPS by preventing binding of LPS to cytosolic inflammatory caspases. Indeed, SALPs strongly inhibited intracellular LPS-induced inflammatory responses in monocytes and macrophages after transfection with LPS or stimulation with Escherichia coli OMVs. Importantly, additionally to reducing TNF and IL-1β secretion, they prevented cells from pyroptosis, which was shown to be the main driver for septic shock. In contrast, the TLR4 inhibitor TAK-242 reduced TNF and IL-1β release induced by LPS, but failed to inhibit pyroptosis, which could explain why TLR4 inhibitors have met with little success in late stage clinical trials as anti-septics and further indicates a decisive advantage of SALPs to overcome limitations of TLR4 inhibitors. Additionally, P2X7 receptor (P2X7R)-mediated endocytosis of Pep19-2.5 was revealed as a potential mechanism for cytoplasmic LPS neutralisation. Besides triggering sepsis, bacterial pathogenicity factors can provoke prolonged elevation of pro-inflammatory cytokines in the skin and elongate the inflammatory stage of wound healing, which can result in the formation of chronic wounds. Further, chronic wounds are frequently caused by multi-drug resistant bacteria and mostly composed of multiple microbial species, thus requiring a therapy mainly targeting the inflammation and possessing a broad-spectrum activity. Importantly, these requirements were fulfilled by SALPs which inhibited TLR2- as well as TLR4-triggered inflammatory responses in various skin cells, and additionally suppressed intracellular LPS-induced pyroptosis in keratinocytes and non-canonical inflammasome activation in macrophages, which are important sentinels in inflamed skin. Bacterial infections can lead to impaired wound healing and re- epithelialisation is critical for efficient wound closure, which is significantly regulated by proliferation and migration of keratinocytes from the wound edges. Remarkably, Pep19-2.5 promoted keratinocyte migration already at very low concentrations, while proliferation was not affected. The present study provides important insights into the mechanism of Pep19-2.5-induced cell migration involving metalloprotease-mediated epidermal growth factor receptor (EGFR) transactivation, which is in accordance with other natural and synthetic AMPs. A pivotal bridging role of the P2X7R in the peptide- metalloprotease/EGFR stimulatory axis was disclosed, which was implemented via intracellular calcium-induced reactive oxygen species release followed by activation of metalloprotease-mediated EGFR transactivation. Moreover, Pep19-2.5 accelerated wound healing in vivo in un-infected and methicillin- resistant Staphylococcus aureus-infected wounds. Immunomodulatory activities that were discovered as a novel characteristic of SALPs in this study, were shown to be mediated mainly via P2X7R activation, giving this receptor a decisive role for peptide-induced cellular responses. Collectively, this study discloses an additional and highly relevant pathway involved in the protective effect of SALPs against sepsis and gives new insights into the mechanism of peptide-mediated neutralisation of cytoplasmic LPS. Additionally, this work suggests the potential application of Pep19-2.5 in the treatment of acute and chronic wounds and SSTIs, preferably in combination with antibiotics to merge the anti-inflammatory and re-epithelialisation-promoting effect of the peptide with the direct antimicrobial effect of an antibiotic. Further, it provides insights into the mechanism involved in Pep19-2.5-induced wound healing. The present work further indicates a crucial role of the P2X7R for Pep19-2.5-mediated immunomodulatory activities.
Die Weltgesundheitsorganisation stuft Antibiotikaresistenzen als eine der größten Bedrohungen für die Gesundheit der Menschen ein und verdeutlicht damit den dringenden Bedarf an neuen Therapieoptionen. Dies trifft insbesondere auf Haut- und Weichteilinfektionen (SSTIs) zu, die hauptsächlich von den sogenannten ESKAPE-Erregern verursacht werden, die zu den hartnäckigsten Bakterien gehören und Resistenzen gegen fast alle gängigen Antibiotika aufweisen. Konventionelle Antibiotika können zwar Bakterien abtöten, aber gleichzeitig die Freisetzung von Pathogenitätsfaktoren von der Bakterienzellwand hervorrufen, die die verursachenden Auslöser einer Sepsis darstellen. Synthetische anti-Lipopolysaccharid Peptide (SALPs) binden und neutralisieren Pathogenitätsfaktoren von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien und verhindern daher die LPS- oder Lipopeptid-vermittelte Überaktivierung von Toll-like Rezeptor (TLR)4 bzw. TLR2 und zeigten in vivo einen protektiven Effekt gegen Sepsis. Allerdings scheiterten TLR4 Inhibitoren in klinischen Studien für die Behandlung einer schweren Sepsis, was vermuten lässt, dass ein TLR4-unabhängiger Mechanismus für die Entstehung einer Sepsis maßgeblich ist. Tatsächlich stellte sich die Erkennung von zytoplasmatischem LPS über inflammatorische Caspasen im Zytosol, die zur Pyroptose und Aktivierung des nicht-kanonischen Inflammasoms, gefolgt von Caspase-1 vermittelter Reifung von IL-1β und IL-18, führt, als entscheidender Auslöser für die Entwicklung eines septischen Schocks heraus. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass LPS über äußere Membranvesikel (OMVs) in das Zytosol befördert wird. Diese werden von Gram-negativen Bakterien während aller Wachstumsphasen und als eine adaptive Reaktion auf Stress sezerniert. Da SALPs die Bindung von LPS an den TLR4 verhindern können, konnte vermutet werden, dass sie zusätzlich die Immunantwort, die durch intrazelluläres LPS ausgelöst wird, blockieren können, indem sie die Bindung von LPS an die zytosolischen inflammatorischen Caspasen unterbinden. Tatsächlich waren SALPs in der Lage, die Entzündungsreaktionen, die durch intrazelluläres LPS nach Transfektion von Monozyten und Makrophagen mit LPS oder Stimulation mit Escherichia coli OMVs ausgelöst wurden, zu unterdrücken. Hervorzuheben ist, dass sie zusätzlich zur Reduktion der TNF und IL-1β Sekretion die Pyroptose der Zellen verhindern konnten, die sich als treibende Kraft für die Entwicklung eines septischen Schocks herausgestellt hat. Der TLR4-Inhibitor TAK-242 dagegen konnte zwar die LPS-induzierte TNF- und IL-1β-Freisetzung reduzieren, war allerdings nicht dazu in der Lage, Pyroptose zu unterdrücken, was eine mögliche Erklärung für den geringen Erfolg der TLR4-Inhibitoren in den späten Phasen der klinischen Studien als Anti-Sepsis Therapeutika sein könnte, und zusätzlich den deutlichen Vorteil von SALPs kennzeichnet, die Limitationen von TLR4-Inhibitoren zu überwinden. Zusätzlich wurde P2X7 Rezeptor (P2X7R)-vermittelte Endozytose von Pep19-2.5 als potenzieller Mechanismus für die Neutralisierung von zytoplasmatischem LPS aufgedeckt. Pathogenitätsfaktoren können neben dem Auslösen einer Sepsis auch eine anhaltende Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen in der Haut hervorrufen und die Entzündungsphase der Wundheilung verlängern, was in der Entstehung von chronischen Wunden resultieren kann. Zusätzlich werden chronische Wunden häufig von multiresistenten Bakterien verursacht und weisen meistens polymikrobielle Erreger auf. Daher sollte deren Therapie hauptsächlich auf die Entzündung abzielen und eine Breitspektrum-Aktivität aufweisen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Voraussetzungen von SALPs erfüllt werden, da sie sowohl TLR2- als auch TLR4-hervorgerufene Entzündungsreaktionen in diversen Hautzellen unterdrückt haben, und zusätzlich durch intrazelluläres LPS induzierte Pyroptose in Keratinozyten und nicht- kanonische Inflammasom-Aktivierung in Makrophagen verhindert haben, die wichtige immunkompetente Zellen in entzündeter Haut darstellen. Bakterielle Infektionen können zu beeinträchtigter Wundheilung führen und die Re- epithelialisierung, die essentiell für den Wundverschluss ist, wird überwiegend von der Proliferation und Migration von Keratinozyten von den Wundrändern reguliert. Bemerkenswerterweise förderte Pep19-2.5 die Keratinozytenmigration bereits in sehr geringen Konzentrationen, während es keinen Einfluss auf die Proliferation aufwies. Die vorliegende Arbeit gibt Einblicke in den Mechanismus der Pep19-2.5-induzierten Keratinozytenmigration und zeigt die Beteiligung Metalloprotease-vermittelter epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR)-Transaktivierung, in Übereinstimmung mit dem Mechanismus anderer natürlicher und synthetischer antimikrobieller Peptide. Zusätzlich konnte eine wichtige Verbindungfunktion für den P2X7R in der Peptid-Metalloprotease/EGFR-Achse aufgedeckt werden, implementiert durch intrazelluläres Calcium-induzierte reaktive Sauerstoffspezies-Freisetzung, gefolgt von der Aktivierung Metalloprotease-vermittelter EGFR Transaktivierung. Darüber hinaus beschleunigte Pep19-2.5 die Wundheilung in vivo von nicht-infizierten und Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus- infizierten Wunden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass immunomodulatorische Funktionen, die in dieser Arbeit als neue Eigenschaft von SALPs aufgedeckt wurden, hauptsächlich über den P2X7R vermittelt werden, was diesem Rezeptor eine entscheidende Rolle für Peptid-induzierte zelluläre Reaktionen zukommen lässt. Zusammengefasst deckt diese Arbeit einen zusätzlichen und hoch relevanten Signalweg auf, der an der protektiven Rolle von SALPs gegen Sepsis beteiligt ist und gibt neue Einblicke in den Mechanismus der Peptid- vermittelten Neutralisation von zytoplasmatischem LPS. Zusätzlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf die potenzielle Anwendung von Pep19-2.5 in der Behandlung von akuten und chronischen Wunden und SSTIs hin, vorzugsweise in der Kombination mit Antibiotika, um den anti-inflammatorischen und Re- epithelialisierungs-fördernden Effekt des Peptids mit dem direkten antimikrobiellen Effekt des Antibioikums zu vereinen. Ergänzend wurden neue Einblicke in den Mechanismus der Peptid-induzierten Wundheilung gegeben und die entscheidende Rolle des P2X7R für die Peptid-vermittelten immunomodulatorischen Funktionen gezeigt.
